【求助】以包涵体形式存在的目的蛋白的表达问题

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标题:【求助】以包涵体形式存在的目的蛋白的表达问题

cbou876[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小女子的实验进行的步履艰辛，持续抓狂中~~有如下问题，请各位赐教。
1、我的目的蛋白表达，对小批量菌液（20ml）进行诱导时，可见目的基因的表达，且诱导条件已经优化，表达量也比较高。高兴之际正想进一步大量表达纯化，即扩大摇菌量（100ml以上）（其他条件都是一样的）诱导，目的基因的表达量却少的可怜，甚至不表达。。。重复几次都是这个结果，这是为什么呢？
ps:我应用的表达宿主菌为BL21(DE3)PlysS，载体为pET32+
2.实验室有人怀疑是我的目的基因有毒性造成的，可如果是毒性基因导致的，为什么小量菌液诱导就能大量表达呢？
而且我的目的蛋白是以包涵体形式存在的，我见原核表达中文手册中有提到，即使是毒性蛋白，以无活性的包涵体形式表达也不会影响宿主菌的生长。所以不知道这个怀疑是否成立？

cbou876[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请知道任何信息的大侠快快回帖哦，我好着急啊，
其临床表现为脸上的痘痘以每天一颗的速度持续增长，梦里都是IPTG之类的东东~~~呜呜
好想赶快摆脱这噩梦啊~

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发酵的放大不是简单的体积放大，这点对于摇瓶来说影响还比较小，到了罐上影响就大了。
所以，希望你提供下实验的步骤以及具体的条件，供大家分析。
初步考虑是诱导时机和收获时机的问题。建议做下生长和表达量的时间曲线。

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该和目的蛋白的毒性有关。小量表达时，你的菌种还没有进行自身的进化筛选，等到大量表达时，菌种已完成了自筛选工作，多为不表达目的蛋白的菌了，虽然质粒测序正常。
解决办法：取出保存的质粒，重新转化涂平板，注意平板要加葡萄糖，以抑制目的蛋白的表达，防止菌种的自身筛选发生。在进行菌种保存时，试管或小摇瓶中也要加葡萄糖。
完成菌种保存后，再做发酵诱导时，可分两步进行。
首先，用LB+glucose（0.5-1%）进行菌体增殖；
第二步，在用IPTG诱导前，将发酵的菌低速离心，如2000-4000rpm，2min，去除含葡萄糖的培养基后，加入含IPTG的LB培养基轻摇重新悬浮菌体，放到摇床上诱导2-3小时。
本法的核心内容为葡萄糖抑制有毒目的基因的表达，防止菌体的自身进化筛选，维持工程菌的表达能力。
本人用此法完成过4个与楼主相似情况的发酵表达，方法绝对可行。做好后可来此反馈。
祝好运！

cbou876[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有个问题，诱导前加入的新鲜培养基中无须再加葡萄糖了吗？

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 cbou876 于 2014-1-9 14:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有个问题，诱导前加入的新鲜培养基中无须再加葡萄糖了吗？

菌体离心后所加入的培养基不能含有葡萄糖，这时候是诱导阶段，葡萄糖会抑制表达。

guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

适当多加一些antibiotic

cbou876[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

培养基中添加葡萄糖，果然有效~~
多谢各位的关心与帮助，今天的结果还不错，可见目的基因的表达啦~~只是还需要进一步优化~

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

>你在帖子中提到诱导阶段加入葡萄糖会抑制表达，为什么?
> 毒性基因的表达时，加入葡萄糖能增加质粒的稳定性，这个作用只是在增殖阶段么？诱导阶段加了葡萄糖反而会抑制表达了？
> 急盼回复！！

===========================================================================================================

建议看看PET system manual这本小册子，以及“从纯化到星辰”这篇文章。搜索一下，在园子里都有。关于葡萄糖的抑制原理表达的比较清楚。
葡萄糖对大肠杆菌的增殖效应非常明显，而且会抑制表达，这种抑制是不管增殖还是诱导阶段的。所以，在我所建议的试验步骤中有离心换培养基诱导。通俗一点讲，在诱导阶段，我们不用管菌的死活了，只要它顺利的表达出目标蛋白就可以了。而且，在这个阶段，菌体的增殖量不多了，已有的菌由于增殖阶段葡萄糖的抑制作用，质粒的表达功能都存在着。
你的试验不是做成功了吗？为什么现在又有这个问题？
ps:这个方案对摇瓶培养诱导没有问题，但在做发酵罐时，情况是不一样的。摇瓶和发酵罐在培养基组成和操作方式上差别较大。

daod[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 cbou876 于 2014-1-9 14:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

小女子的实验进行的步履艰辛，持续抓狂中~~有如下问题，请各位赐教。
1、我的目的蛋白表达，对小批量菌液（20ml）进行诱导时，可见目的基因的表达，且诱导条件已经优化，表达量也比较高。高兴之际正想进一步大量表达纯化，即扩大摇菌 ...

看鸟1眼你的问题，感觉你的放大是在碰运气哈。
问几个问题，容器和培养基装量是否1致？转速是否1致？接种量是否1致？诱导前菌密度是否1致？pH值？然后IPTG诱导前葡萄糖是否代谢消耗完以及IPTG与菌密度的量效关系？表达开始后是靠什么碳源氮源支持？........。
这些实验数据都没有，那放大9很难完成。1定要在摇瓶阶段把相应的条件比较出来，5、50、100升才会容易些。
另外目的蛋白是否有细胞毒性，从你20ml的那个实验加人诱导剂后的菌体密度的变化9可以判断。以前邵教授问过我类似的问题，这个还要和噬菌体污染区分开啊。
我们学生刚开始都跟你1样，没关系，只要立志要在这个领域建功立业，多下点功夫还是大有希望的。