【求助】抗菌肽分离纯化，苦恼中...

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标题:【求助】抗菌肽分离纯化，苦恼中...

吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是做一种抗菌肽的酵母重组表达，分子量是7kDa，等电点11点多，好不容易表达出来了，老板又让继续往下分离纯化。前一个月用CM 阳离子柱分的，效果挺好的，只出现了一个单峰。为了除去分子量大的干扰蛋白，接着又用10kDa的超滤膜分了一次，后来跑电泳没有发现条带，活性也不明显，我怀疑是纯化的过程中目标蛋白纯化没了，活性也丧失了。
现在再打算换种方法，还是用CM 阳离子柱分，想用醋酸铵做缓冲液，这样可以直接冻干除去醋酸铵，但是洗脱液该选用什么呢？用NaCl洗脱的话，岂不是又带入了盐离子？
还有是先超滤掉大分子的蛋白再分离呢，还是直接先用离子交换再超滤呢？
小女子请教各位师兄师姐啦~

yes4[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

离子交换洗脱大多是用盐梯度或盐阶段洗脱的，缓冲液中的盐可以通过过柱（如过G25或G15）或透析（低截流分子量的）等简单方法除去。所以，阳柱最好还是选择常用的缓冲液为好，多改变一下其Ph 和洗脱条件，也能除去杂质，使目的蛋白的纯度提高。你的杂蛋白主要是10kD以上的吗？由于超滤的目的蛋白是滤过的，那么会很快超滤完，所以我想超滤在离子交换前或后问题都不是太大。个人愚见。

ffaa[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.是不是没有收到峰？
2.存放的溶液环境目的蛋白不稳定？（目的蛋白对pH、温度、金属离子的稳定性？）

吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 yes4 于 2014-1-9 14:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

离子交换洗脱大多是用盐梯度或盐阶段洗脱的，缓冲液中的盐可以通过过柱（如过G25或G15）或透析（低截流分子量的）等简单方法除去。所以，阳柱最好还是选择常用的缓冲液为好，多改变一下其Ph 和洗脱条件，也能除去杂质，使目的蛋白的纯 ...

谢谢您。
恩，在没有分离之前跑的电泳发现大部分杂蛋白都比较大，应该都在10kDa以上的。超滤先后的问题是因为在跑完柱子以后把样品冻在了-20，超滤的话需要反复冻融，我担心对蛋白的活性有影响。
我看咱园子里有说用醋酸铵缓冲液纯化后冷冻干燥,真空干燥,旋转蒸发都可以去除盐成分的，可以省去好多步骤，对活性影响小一点吧~

ukonptp[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试验设计错误！超滤不是用来纯化蛋白的。应用10kd的膜想分离7kd和10kd的蛋白完全是想当然了。
晚上我再来说说这个问题。

吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ffaa 于 2014-1-9 14:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1.是不是没有收到峰？
2.存放的溶液环境目的蛋白不稳定？（目的蛋白对pH、温度、金属离子的稳定性？）

恩，我用1M NaCL的线性梯度洗脱只有一个峰，应该就是我想要的东西吧。
过完柱子以后我就直接溶在缓冲液里了，甘氨酸-NaOH，有报道说我这个肽对pH，温度都挺稳定的，可就是后来没有活性。

gogo[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 吉吉0120 于 2014-1-9 14:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是做一种抗菌肽的酵母重组表达，分子量是7kDa，等电点11点多，好不容易表达出来了，老板又让继续往下分离纯化。前一个月用CM 阳离子柱分的，效果挺好的，只出现了一个单峰。为了除去分子量大的干扰蛋白，接着又用10kDa的超滤膜 ...

就抗菌肽酵母表达本身就是个难题，既然这个你都攻克了，还怕啥啊
不知你表达的是什么抗菌肽有7KD这么大，就我表达的抗菌肽由于其分子量小，具有耐热的功能，所以纯化时可以先把粗液加热，使大部分杂蛋白变性沉淀下来，这样，接下来的纯化就方便多了，希望能给你有所帮助。
祝好运！

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发表于 2014-1-9 14:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，我看错了，还以为杂蛋白是100kD的哪。skykiller 战友说的有道理，超滤大多是用来浓缩或换缓冲液的，是不能将分子量差距这么小的蛋白质分开的，即使是分子筛也是不太可能。你可多将CM 柱的条件优化一下，比如改改缓冲液的Ph、梯度等。还可以再试试疏水层析将其分开。

吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

就抗菌肽酵母表达本身就是个难题，既然这个你都攻克了，还怕啥啊
不知你表达的是什么抗菌肽有7KD这么大，就我表达的抗菌肽由于其分子量小，具有耐热的功能，所以纯化时可以先把粗液加热，使大部分杂蛋白变性沉淀下来，这样，接下来的纯化就方便多了，希望能给你有所帮助。
祝好运！

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谢谢您~您的建议不错！
你一般都加热多长时间啊？文献上报道80度5分钟还能保持活性，我该怎么加热才最合适呢？

吉吉0120[使用道具]
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发表于 2014-1-9 14:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试验设计错误！超滤不是用来纯化蛋白的。应用10kd的膜想分离7kd和10kd的蛋白完全是想当然了。
晚上我再来说说这个问题。

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恩，好的，嘿嘿，恩，还有我用超滤不是为了将10kDa和7kDa的分开，是为了粗略的将大于7kDa的杂蛋白除去。因为在没有分离之前我跑电泳发现大部分的杂蛋白都在10kDa以上，所以就这么来了。

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