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标题:【讨 论】蛋白纯化

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-1-9 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨 论】蛋白纯化


我每次用硫酸氨沉淀蛋白然后用50mM Tris-Hcl 重溶沉淀,但沉淀溶解很少不知是什么原因?
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发表于 2014-1-9 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
每次?
你做的同一个蛋白吧?
有的蛋白做硫酸铵沉淀是会有这样的情况的,硫酸铵是比较温和但并不是其沉淀就一定可以复溶.
你做硫酸铵沉淀前样品存在的体系是怎么样的? 就只是50mM Tris吗? 如果不是用回原来的体系试试,也可以试试改变一下其他条件,比如盐浓度,pH值,加点去垢剂,还原剂等.
不过我认为如果硫酸铵沉淀行不通可以换其他方式的,没必要花那么大的精力在复溶上面,除非你硫酸铵沉淀的效果特别好.
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发表于 2014-1-9 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是同一个蛋白
我做的是包涵体,用稀释复性.体积比较大,然后用硫酸氨进行浓缩,需要浓缩的量有1L,硫酸铵沉淀前样品存在的体系很多成分,用来复性里面加了很多东西.而且硫酸氨浓缩的同时还能去掉一部分杂蛋白.问题和上面一样复溶率不高
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发表于 2014-1-9 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 yyaxw84 的帖子

这就难怪了.
在这里我想你用硫酸铵是又使蛋白变性了,.
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发表于 2014-1-9 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你是怎么样判断你的蛋白复性了呢?
样品的浓缩建议你用超滤的方法.
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发表于 2014-1-9 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白在没复性前是单体,复性后是四聚体通过跑胶可以看的到.超滤也可以但量比较大,我在硫酸氨浓缩同事可以去掉一部分杂蛋白.
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发表于 2014-1-9 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你浓缩后准备做什么呢？怎么样分开复性与没有复性的蛋白呢？
现在的问题是你做硫酸铵后沉淀无法溶解，极有可能蛋白又变性了，所以只好尝试其他的办法。包涵体复性出来的样品再使其沉淀，往往都会导致再次变性的。
而我们这里包涵体复性后浓缩都是采用超滤的方法，我觉得你可以试一试，1L并不大，我们10L的都照超。 good luck!
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发表于 2014-1-9 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白又变性有这种可能,你们做超滤用什么仪器,超滤管,应该不是,超滤管每次量很少.
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发表于 2014-1-9 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

小量的用超滤管可以了.
其他的有超滤杯,或者用到蠕动泵的也有,你上网查一下,这方面的资料很多的.
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-1-9 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位大侠有做过T7 polymerase 的没?我做这个有一段时间了,但纯度提不上去,纯度不到百分之30.我是用PEI先沉淀蛋白,然后用高盐洗涤,再用硫酸氨重溶沉淀.这样做得到的蛋白纯度很小很小,蛋白损失大,我现在急需做出来这东西.,望有做过的师傅给点建议,帮我找找原因.谢谢....
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