【求助】可溶性蛋白的获得

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】可溶性蛋白的获得

30 1/3 1 2 3 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】可溶性蛋白的获得

hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2014-1-9 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在做一个蛋白,发现是个可溶性蛋白,老板要求在上清中获得这个蛋白,但是,我用 PEG6000沉淀 1.2000G离心30分钟竟然什么也没有?菌液是500ML,PEG600=35g,请问有什么其他经典的好方法呢? 我是新人!

ritou1985[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77664
精华 0
积分 644
帖子 948
信誉分 100
可用分 5596
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2014-1-9 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

重组到pET或 pGEX系列载体里,你就可以通过his 或GST标签纯化它了.

wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态离线

发表于 2014-1-9 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在做一个蛋白,发现是个可溶性蛋白,老板要求在上清中获得这个蛋白,但是,我用 PEG6000沉淀 1.2000G离心30分钟竟然什么也没有?菌液是500ML,PEG600=35g,请问有什么其他经典的好方法呢? 我是新人!

===========================================================

分离蛋白的方法还是比较多的吧
根据你蛋白的特点吧初级分离一般选择离子交换吧
也可以向楼上的说的克隆到商业化载体中，一般都有融合标签的，诸如his tag
然后就可以用亲和层析了

skytree[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76459
精华 0
积分 372
帖子 444
信誉分 100
可用分 3026
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2014-1-9 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、先确定有表达，而且是可溶性表达。
如果是E.coli.表达，可以用少量破菌上清做SDS－PAGE分析；如果是酵母，先要搞清楚是分泌表达还是胞内表达；如果是CHO表达，大致的表达量怎么样；如果是.......。你问问题不说清楚条件是不对的。
2、你用PEG6000沉淀的样品是什么？培养上清还是破菌上清,还是.....？
该不会你把PEG直接加到大肠杆菌发酵液中了吧？还是那句话，条件不清楚。
3、 PEG6000沉淀 1.2000G离心30分钟竟然什么也没有?
这句话是什么意思？是没有沉淀呢还是沉淀中没有目标蛋白？,如何确定没有的？
PEG6000沉淀和其浓度相关，35g/500ml稍微偏低了点，可增加浓度试一试。
浮躁啊浮躁。急急忙忙地来发帖求帮助，但试验条件又不说清楚，好多好多新园友总是犯这样的问题。别人可不是你的试验指导老师，对你的试验情况都完全了解啊。

hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2014-1-9 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我得到的蛋白SDS-PAGE胶,有表达,而且在上清,沉淀都有.问题是现在,500ML扩大培养后,怎么把培养基中的可溶蛋白沉淀出来.

hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2014-1-9 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2、你用PEG6000沉淀的样品是什么？培养上清还是破菌上清,还是.....？
该不会你把PEG直接加到大肠杆菌发酵液中了吧？还是那句话，条件不清楚。

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

我做的是500ML扩大培养后,12000g. 4度离心.获得上清,然后加了PEG,按文献中的最适的PEG量,但是没有沉淀(目的蛋白和其他沉淀都没有,就是说没有任何沉淀,我想得到的是目的蛋白).然后上清在12个小时后,SDS-PAGE胶,发现没有目的蛋白了.
道歉:
我最近试验忙,说话没说清!谢谢各位大虾

hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2014-1-9 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想得到的试验结果是,直接扩大培养后,直接在培养上清中得到可溶的蛋白.而不需要变性和复性这个过程,因为,包涵体是不可溶的.包涵体的方法我试过了!

skytree[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76459
精华 0
积分 372
帖子 444
信誉分 100
可用分 3026
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2014-1-9 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

直接在培养上清中得到可溶的蛋白
你的意思是说你的目标蛋白分泌到大肠杆菌培养的培养基中了？什么表达载体和宿主菌、大肠杆菌还有这个功能？第一次听说。

hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2014-1-9 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 skytree 于 2014-1-9 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

直接在培养上清中得到可溶的蛋白
你的意思是说你的目标蛋白分泌到大肠杆菌培养的培养基中了？什么表达载体和宿主菌、大肠杆菌还有这个功能？第一次听说。 ...

恩,我在50ml扩大培养和500ml扩大培养,我不敢肯定是可溶的分泌性蛋白,当然也不排除是菌体破碎將蛋白释放到培养基中,所以,我要试下,按提病毒蛋白的方法,看看能不能得到目的蛋白哦,但是无结果.

idea2011[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77656
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2014-1-9 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有的蛋白可以在大肠杆菌中分泌性表达，你可以考虑换方法，你的蛋白分子量多大？知道PI吗？

30 1/3 1 2 3 ››