【求助】我如何来分离纯化我的昆虫细胞表达产物？

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标题:【求助】我如何来分离纯化我的昆虫细胞表达产物？

紫烟[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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感染
我用昆虫细胞表达了一个蛋白，细胞培养上清(即培养液)和感染细胞冻融裂解后的上清做SDS-PAGE,在目的条带附近都有一个带，继续做免疫印迹，用原核表达产物制备的兔血清做一抗反应，结果在细胞培养上清和感染细胞冻融裂解后的上清中都有反应。看来我的蛋白在细胞培养上清和感染细胞中都有表达。
现在，我不知道如何来分离纯化我的表达产物，细胞培养上清中还有血清存在，真是一筹莫展，希望得到大家的指点和帮助！万分感谢！

8princess8[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在做昆虫细胞表达，
我不怎么清楚你说的意思

8princess8[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的时候是收集细胞
然后SDS-PAGE检测有表达没有
然后破碎细胞
离心
取上清纯化

8princess8[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

只有在细胞破碎以后上清里面才有蛋白（就是裂解液）
沉淀？你说的沉淀是什么？细胞破碎以后离心的沉淀吗？
一般细胞破碎以后基本没有什么沉淀

yonger[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由紫烟于 2014-1-9 16:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

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我用昆虫细胞表达了一个蛋白，细胞培养上清(即培养液)和感染细胞冻融裂解后的上清做SDS-PAGE,在目的条带附近都有一个带，继续做免疫印迹，用原核表达产物制备的兔血清做一抗反应，结果在细胞培养上清和感染细 ...

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紫烟[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很抱歉，一着急，没把帖子说清楚，我已经修改过了。是在细胞培养液和细胞中都有表达，我用的是Bac-TO-Bac系统，pFastBac™HT B载体带有6his标签。

ero11[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

pFastBac™HT B载体应该是不分泌的,所以应该是不会分泌到细胞培养基中,细胞培养基中的检测到蛋白,可能是因为有细胞破裂了.
Bac-TO-Bac系统一般都是用细胞裂解物纯化的.

大尾巴[使用道具]
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