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标题:【求助】WB，我该怎么办

wiwi[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB，我该怎么办

我用的是恒压，湿转，bio－rad，100V2H,老是效果不好，我的蛋白58KD，我发现恒压的过程中，电流基本上都在1A以上，缓冲液都沸腾了，因为我是在跟国外的博士后后面作实验，我想换条件，但是他老不换，所以转膜一直在折腾，效果一直不好，快一个月了烦死了，天天在弄这个．以前在学校用的半干转，恒流，效果很好，到这里只有伯乐的湿转仪．晕啊，我认为还是恒流好，不知道为什么恒压１００v，电流怎么那么高，buffer boiling
用丽春红Ｓ染色，基本上看不到什么条带，我的蛋白浓度是按梯度来上样的，预染ＭＡＲＫＥＲ有的时候转的时候，但最后ECL显色看不到目的条带，昨天做了（经过细微改进）一次，在膜上看到预染ＭＡＲＫＥＲ最大分子量的带和最小分子量的带转的很清晰，但中间的就看见一条带，还斜的很，最后ECL，能看见前四个蛋白浓度梯度的目的条带（1：2　１：４　1:１６　１：６４）但是我在溴酚蓝终点指示位置下面，这四个浓度梯度下面膜上大量的蛋白聚集在一起,非常乱，不知道什么原因！请大家给我分析分析。谢谢！
另外补充一下，我的蛋白浓度很高的，是经过纯化的蛋白，经过bradford检测，我的蛋白经过1:4096稀释，OD值都>3
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那个国外回来的家伙估计用的是能循环制冷的湿转系统，能长时间保持在4度低温，所以效果会很好。
你转的时候没有在转膜槽周围敷上冰块降温，2h还真的会沸腾。不过1A的电流实在是大了点，是不是电转液该换了？（只能用3-5次）
建议在转膜前将电转液置于4度冰箱预冷，然后在转移时敷上冰块。
开始电流200mA多点，结束时不到400mA为正常。
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发表于 2014-1-9 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

冰块降温肯定是要用得，因为放在冰箱里对冰箱会有影响，所以都在实验台上进行得，我们还参照Bio-rad得方法，在转移槽里面放了个转子，也就是所谓得让buffer 循环，buffer prepared fresh everytime，电流实在是太高了，一小时后就沸腾了，烫死了，这个做法做得商榷，大家帮我分析分析。
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

开始时电流是多大？
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发表于 2014-1-9 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #4 kuaizige 的帖子

开始时候电流就很大 达到1A以上
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发表于 2014-1-9 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有2种选择，（1）恒流，200-250mA，100min；（2）恒压，80-100v， 60-10 min，效果都还可以。转膜缓冲液最好用新配制的，因为甲醛的原因，同时溶液需要放在4度预冷后使用，能有效降温，加最好加上预染MARKER，可以监测转膜的情，整个电泳槽也要注意降温，否则膜真的烧啦，有事情可以再问：）
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发表于 2014-1-9 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wiwi 于 2014-1-9 16:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
开始时候电流就很大 达到1A以上

要么是电转缓冲液有问题，要么是电压不是100v。
刚开始就1A绝对不正常！！！！
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发表于 2014-1-9 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
把你转移时电泳仪的照片发过来，我看下电流和电压都是多大
把你的转移液配方贴上来
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wiwi[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天正在做的
我做了监测
100V 0h 0.64A
100V 1h 1.96A
1h later >2A
我的buffer配方:
Tris Base(Trizma)25mM 3.94g
Glycine 192mM 14.41g
Methanol 15% 150ml
SDS 0.01% 100mg
MiliQ H2O 1L ph8.3
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发表于 2014-1-9 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们130KD的蛋白在恒流300mA的情况下只要2h,恒压60V4h,你的需要那么多的时间吗?
我们有人转60kd左右的在恒压70v的情况下两小时就有点过了,1个半小时差不多
另外我们一直都是直接放在冰箱里面转的,四周还加冰
"但是我在溴酚蓝终点指示位置下面，这四个浓度梯度下面膜上大量的蛋白聚集在一起,非常乱，不知道什么原因！"是不是电泳不好啊~你的tris-hcl有没有检测一下PH值呢?
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