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标题:【求助】超声波裂解

04906[使用道具]
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发表于 2014-1-9 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】超声波裂解

超声波裂解5次，发现蛋白变黑，对免老鼠会不会有影响？
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-1-9 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请先确认变黑的原因。如果纯化后获得的纯品蛋白仍然是黑色的就 不要用了。
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qiangren789[使用道具]
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发表于 2014-1-9 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你超声裂解的条件是什么？可能功率太大打焦了，只是部分损失，应该还有没问题的蛋白，改变下超声条件
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 小中大

你仅仅是裂解黑了，还要进行下一步纯化吧，一般都对纯化不会有太大影响！
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04906[使用道具]
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发表于 2014-1-9 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位，我的条件是3s，3s，99，后来重新诱导了。
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发表于 2014-1-9 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚开始做表达，现在遇到了超声无法破碎菌液的问题。表达后的菌液沉淀重悬后一开始是乳白色，400W功率，超声30min后都基本没变化的。我用的是pET-32a的载体，以为是包涵体表达所以就改为低温长时间诱导，可结果还是一样，菌液无法超声至澄清。中间换过两次细菌裂解液也没起作用。我得到的沉淀跟上清分开跑胶，结果，沉淀中杂带很少，甚至就一条带，而上清中却很多杂带，几乎就看不到我的目的条带。请问各位有没有什么好的建议？
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发表于 2014-1-9 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚开始做表达，现在遇到了超声无法破碎菌液的问题。表达后的菌液沉淀重悬后一开始是乳白色，400W功率，超声30min后都基本没变化的。我用的是pET-32a的载体，以为是包涵体表达所以就改为低温长时间诱导，可结果还是一样，菌液无法超声至澄清。中间换过两次细菌裂解液也没起作用。我得到的沉淀跟上清分开跑胶，结果，沉淀中杂带很少，甚至就一条带，而上清中却很多杂带，几乎就看不到我的目的条带。请问各位有没有什么好的建议？
沉淀没有杂带，说明你的菌已经被超声裂解了，不澄清是因为有一些细胞碎片，那是怎么打都不会清的，除非你超声的体积很小（0.1mL）才会澄清。
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发表于 2014-1-9 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是这样吗？谢谢！可是有人说，沉淀不可能是没有杂带的，其中应该有很多大肠杆菌本身表达的蛋白质。不知道这种说法对不对？
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发表于 2014-1-9 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 KGZ564 于 2014-1-9 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是这样吗？谢谢！可是有人说，沉淀不可能是没有杂带的，其中应该有很多大肠杆菌本身表达的蛋白质。不知道这种说法对不对？


如果你表达的蛋白是包涵体形式存在的，那就基本都在沉淀里，沉淀里面有菌体蛋白，大概与目的蛋白各占50%的比重吧，这个要看你包涵体洗的是否干净！没有杂蛋白是不可能的，如果没有的话，也就没有必要做纯化了！
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发表于 2014-1-9 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天上午又做了一次超声，可能换了裂解液，而且重悬的体积加大了，所以超声之后基本透明了。还需跑胶验证！
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