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标题:【求助】我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一！

veiwu[使用道具]
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发表于 2014-1-14 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一！

各位：
我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一，不知为何呢？（且两边的2条带经常出不来）
注：同一个样品，一管中加入待测样品和LB，混匀、煮5min ， 离心一会，取上清于新EP管中，混匀后上样。
转膜也是常规操作啊，60V，2h;洗膜后奶粉封闭1--2h，以抗过夜，洗膜、二抗1-2h;洗膜、ECL显影、曝光。
用的是乐扣最小的饭盒来封闭、洗膜、孵育抗体的。
个人觉得加样应该没问题，但转膜及孵育抗体似乎也挑不出毛病，郁闷至极。还请高人指点一番！
诚谢！
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S6044[使用道具]
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发表于 2014-1-14 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得还应该是蛋白上样量的问题
在蛋白提出来以后，我觉得应该有必要先进行一下定量，然后按照胶孔的大小、还有需要样本量的多少，来决定一下该加多少样品
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发表于 2014-1-14 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可是我的蛋白是事先定量好的啊，估计最终上样在几十微克的样子
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发表于 2014-1-14 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

附上一张片子，大伙帮忙找找原因
还缺失了一条带，郁闷！


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发表于 2014-1-14 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

下面更离谱的


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发表于 2014-1-14 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该还是浓度测定的时候出问题了，如果用考马斯亮蓝法，你会发现过几分钟吸光度就会有变化。还有变性后离心后不是直接加样吗？再取上清还是第一次听说哦，难道是我孤陋寡闻
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发表于 2014-1-14 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

兄弟，是不是你蛋白浓度没有测准啊，上样量差别太大吧
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-1-14 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的转膜和抗体孵育确定没有问题吗？没有倾斜之类的吗？只是从另个角度推测一下，不知有没有可能？
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发表于 2014-1-14 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你的问题解决了吗？我也出现了和你一样的问题，而且我也是上样之前定量的，但就是各个样品的内参粗细不均一。如果你的已经解决请一定来这里说说是怎么解决的。提前谢谢你了啊！真的很上火的！
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veiwu[使用道具]
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发表于 2014-1-14 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该不是定量的问题，这是同一个样品啊！
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