【求助】WB过程中，是不是抗体浓度越高越好呢？

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标题:【求助】WB过程中，是不是抗体浓度越高越好呢？

seven7[使用道具]
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发表于 2014-1-14 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我说的在抗体没做出来的情况下，是不是抗体浓度越高越容易做出来呢？我已经用了1:200和1：50做过，都没有条带，博士德公司的人建议我把浓度调低一点，用个1：500？我觉得很诧异，请问一下战友们有没有遇到过这种情况呢？用高浓度做不出来，用低浓度反而做出来的情况呢？另外有没有用过博士德公司的抗体做过WB的，怎么样呢？

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发表于 2014-1-14 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用细胞没做出来，就取肾脏组织做阳性对照，上样达到80ug，一抗浓度用1：200和1：50都没做出来。后来向公司投诉，他们把做出来的结果发给了我。

附件

2014-1-14 15:14

71794166.snap.jpg (23.04 KB)

seven7[使用道具]
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发表于 2014-1-14 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前两条比较浓的粗带是他们公司用心肌和骨骼肌做出来的（竟然有两条带），而第三条是肾脏的，而我需要的就是肾脏，条带很淡。问他们公司用的什么条件，第一个人（据说是技术人员）说是用1：200，上样80ug,我说我的细胞提蛋白的时候量比较少，很难达到80ug的上样量，他就说让我提高一抗浓度，他已经用了80ug，1：200了，我还应该怎么做，而且我也试做过。我就打电话给那个销售人员，她又告诉我说刚才他说错了，她们是用1:1000做的,我很诧异。我说我用高浓度都做不出来，于是她就建议我用1：500试试。晕死，我都不知道怎么办啦？

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发表于 2014-1-14 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

只是听说过抗体浓度大容易导致非特异性
还真听说过高浓度没条带低浓度能做出来的情况哈哈
怀疑是你其他步骤出问题了毕竟western步骤很多几乎每一部都能够影响最终结果
不知道你说的那个抗体公司抗体质量如何，如果是新手的话，
还是推荐去买名牌公司的抗体吧等做出结果了再考虑更换便宜一点的抗体
还有就是做不出条带的可以先做阳性对照的或者先做dot blot也可以
bless 记得多和隔壁实验室做western的牛人多交流。。。

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发表于 2014-1-14 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

阳性对照是做过的，同一次跑胶的ACTIN也能做出来，就是这个抗体做不出来。

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发表于 2014-1-14 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 seven7 于 2014-1-14 15:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我说的在抗体没做出来的情况下，是不是抗体浓度越高越容易做出来呢？我已经用了1:200和1：50做过，都没有条带，博士德公司的人建议我把浓度调低一点，用个1：500？我觉得很诧异，请问一下战友们有没有遇到过这种情况呢？用高浓度做不出来 ...

浓度要合适才行
有你说的这种现象
建议你看《抗体技术实验指南》
good luck

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发表于 2014-1-14 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议楼主查查文献在你做的目的组织中有没有desmin表达
我记得desmin是结蛋白
在肌类型组织中表达

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发表于 2014-1-14 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果真有这种情况的话，我就把抗体浓度再调低一点试试。不知道你说的这本书哪里有？