【求助】好奇怪的现象啊

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标题:【求助】好奇怪的现象啊

6327555[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做wb发现一个好奇怪的问题，请大家赐教啊。膜上干燥后能看见条带，像染过的那种条带，但不是那种强曝光后的棕黄色条带，而是淡白色的。可是曝光时看不见荧光，也出不来结果。请专家告诉我这是为什么呢？

白白的[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 6327555 于 2014-1-14 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做wb发现一个好奇怪的问题，请大家赐教啊。膜上干燥后能看见条带，像染过的那种条带，但不是那种强曝光后的棕黄色条带，而是淡白色的。可是曝光时看不见荧光，也出不来结果。请专家告诉我这是为什么呢？ ...

首先膜是无论在什么时候都不能全部干燥的，要保持湿润，看上去有淡白色条带也算正常的吧，你可以用立春红染色一下，看看转到膜上去没有。

6327555[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天用丽春红染色了，发现出来的条带跟我的膜干燥状态下看见的条带一模一样，这是为什么呢？膜还没染色的情况下就能看出条带来！到底哪部环节出问题了，真奇怪。请各位大侠帮忙分析下呀。

junhun[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

膜没染色的情况下是能看出条带来的，尤其是PVDF膜，夹子一打开膜稍微一干，顺光条带清晰可见，没问题，继续往下做吧！但是最好别让你的膜全干！

6327555[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢你，可问题是我的膜在浇ECL的时候并没有看见荧光呢，而且也没能压出结果呢。在准备扔掉膜的时候突然发现上面有条带，但这种条带不象因为荧光过亮留下的痕迹。我重复孵育了好几遍抗体，依然做不出来，但是染膜却看见清晰的条带，实在是不明白问题所在！苦恼呀！

windy+++[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那没准是你抗体不好用呢。或者显色液过期。或者二抗不匹配。总之不染色的确可以看出来的，说明你转膜没问题。

6327555[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的抗体都是新的很好的抗体，显色液也没问题。我想问下大家有没有可能是虽然有蛋白，但是蛋白有效成分被降解呢？因为我actin都压了很久没出，做了几个不同的目的蛋白都没出呢。我现在极度怀疑是蛋白的问题，请赐教！

junhun[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

actin非常容易出来！肯定是你的系统哪出问题了！
检查一下你的ECL，是化学发光的吗？上次我们实验室一小师妹初做WB，就把底物买成DAB的了，自己也不懂，拿去就去曝光了，结果片子上怎么都没带，最后发现膜上有黄带！

6327555[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

ECL没问题，是新的pierce的。系统应该没问题的，我做了很多的western，第一次出现这种难题，不明白哪部出错了，我现在只能怀疑是蛋白降解了呢。

c86v[使用道具]
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发表于 2014-1-14 16:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在做western blot 的时候，显影定影，在压完片子之后，我习惯是先把膜留着，对照一下片子，定位之后再扔掉。经常有发现干燥的膜上面会有一条淡黄色的带。
我觉得主要是显色液问题，因为，我们在所有步骤最后加显色液显色，显色液能特异性的结合条带部位的抗体，然后在这个特定的位置显色（这是我们在暗室能够在片子上压出条带的主要原因，也是我们实验的主要目的）。在我们做完实验以后，由于显色液和抗体的相互作用，在膜上留下痕迹，就是后来片子上的那条淡黄色的条带。

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