蛋白质与蛋白组学

看过这两张图后我有几个问题和建议如下：
（1）两次内参出来的条带是否是同样的蛋白样品，如果是，可能说明你的蛋白样品有问题。
（2）电泳的时间有点不够啊，按照你做的胶浓度和电压而言，一般分离胶要1h左右，浓缩胶要2-3小时。
（3）到底是半干转还是湿转，你自己不能区分吗？这两者的条件不一样的，此外你的一抗孵育时间是多少呢？
（4）所配试剂的PH值是否注意到了，你可以再搜集相关方面的材料。
（5）抗体稀释的倍数按照说明书从中间浓度值选择，不要开始就用最大浓度的。
祝你好运！

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首先谢谢您的提问，可是，13问题都是我上面叙述的很详细的，您完全可以再我的叙述中找到答案。PH值我们都调整过了，完全是严格按照要求的！没有问题。抗体稀释倍数也是从中间开始试的。谢谢

1、搂主能否确认样品浓度测量准确？感觉上样量有点少，尽管看到有的文献看到western blot的上样量有30ug的，但还是喜欢用60-80ug。
2、感觉一抗孵育的时间有点短，刚开始摸索实验条件时一般喜欢过夜，甚至是室温过夜。有非特异性条带没有关系，先看到目的条带再说。
3、配胶的试剂是否有问题？ap时间久了？丙稀酰胺是否时间久了？特别是配好的溶液，时间不能太久。

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谢谢您，我这次调整了一下上样量，50ug
另外，一抗也换成过夜了，就是还没有出来结果。
AP每次都是先用现配的，丙烯酰胺时间还好吧，2个星期左右。

建议改进实验条件：
1 加大上样量。上样量与加样孔的底面积有关，上样的蛋白量上限为30ug/mm2载荷面（见“抗体技术实验指南”P169）。如果凝胶板为6cm*8cm，梳子为10个泳道，则每个泳道的底面积为5mm2，可加入的最大蛋白量理论上为150ug。加样量偏少，低丰度的蛋白就很难做出来。
2 既然看不到目的条带，就要减少封闭时间，建议封闭1h。封闭过夜只会适得其反。
3 一抗孵育时间可以延长甚至过夜，这点楼上也说过。
4 二抗浓度1:5000-6000低了点，可以提高到1：2000-3000。
总之Western Blot的影响因素很多，需要仔细优化每一步条件。从你描述的情况暂时先提这几点建议，希望对你有所帮助，祝你好运！

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诚心的感谢您的宝贵意见，我下次做的时候再试一次。谢谢您。

[ 本帖最后由 yes4 于 2014-1-14 17:26 编辑 ]