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标题:【求助】大肠杆菌超声破碎

987789[使用道具]
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【求助】大肠杆菌超声破碎


我取OD值约为0.8的大肠杆菌3mL,离心取沉淀,重悬在10mL的PBS缓冲液中,然后超声波破碎,直接取破碎液用1000x的显微镜观察,可判断破碎完全。
但是将破碎液离心后,取上清和沉淀分别用SDS-PAGE检测,考染,上清样品和沉淀样品都没有任何蛋白条带,请问蛋白质可能跑到哪里去了啊?(在超声波处理后,我的样品产生了大量的泡沫)
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wu11998866[使用道具]
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我认为有以下原因:
1 PBS的体积太大,导致你的目的蛋白浓度过稀。
2 OD为0.8时已过了菌的对数生长期及生长后期,可能菌表达目的蛋白的能力已大大下降。
此外,超声时产生大量的泡沫很正常,超声应在冰上操作。
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tuuu2[使用道具]
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我认为有以下原因:
1 PBS的体积太大,导致你的目的蛋白浓度过稀。
正确。菌液取得太少,PBS的量太大。一般摇瓶培养的菌,100ml菌液对应的破菌液为10-20ml。
2 OD为0.8时已过了菌的对数生长期及生长后期,可能菌表达目的蛋白的能力已大大下降。
不同意。个人认为表达与OD无太大关系,只是与培养基成分的变化有关。虽然很多手册都强调所谓的最佳诱导OD值,你实际做做就会发现没多大关系。最直观的例子就是发酵罐,它开始诱导时的OD值可远远不止这个0.8。
此外,超声时产生大量的泡沫很正常,超声应在冰上操作。
错误。超声时应该完全没有泡沫。泡沫是蛋白质变性的标志之一。超声产生泡沫的原因主要在于你的超声体积太小了,而所用的超声探头直径太大了。
超声不是在冰上操作,而是在冰水浴中操作。这样才能使超声产生的热量快速散发。
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zhenxin[使用道具]
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我以前超声过,产生里很多泡沫,因为是第一次超声,没有经验,问师兄,他说是正常现象。我的体系是200ul的菌液离心后取菌体,用PBS洗,最后用40mlPBS重悬后超声的,这样体积还小吗?
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skytree[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 zhenxin 于 2014-1-14 17:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我以前超声过,产生里很多泡沫,因为是第一次超声,没有经验,问师兄,他说是正常现象。我的体系是200ul的菌液离心后取菌体,用PBS洗,最后用40mlPBS重悬后超声的,这样体积还小吗? ...

你是第一次超声,而我几乎每天都在做超声破菌,你说呢?
超声体积要与超声探头的大小相对应,探头太大,液体太少时,就会产生泡沫,而且会使探头产生空打现象,就是探头所接触的液体都是泡沫,而不是液面下了,这样对超声仪也有极大的损害。
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zhenxin[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 skytree 于 2014-1-14 17:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


你是第一次超声,而我几乎每天都在做超声破菌,你说呢?
超声体积要与超声探头的大小相对应,探头太大,液体太少时,就会产生泡沫,而且会使探头产生空打现象,就是探头所接触的液体都是泡沫,而不是液面下了,这样对超声仪也有极大的 ...

哦,是这样啊,谢谢你啊,我刚做没经验,还请你多多指教!我要虚心向你学习学习:就是说探头要深入液面下,这样是不是不容易产生泡沫,还有你超声时的惯用体积及探头是多大的?谢谢!
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04906[使用道具]
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那一般超声的频率是多少才能使大肠杆菌破裂?具体需要注意哪些细节?请指导指导
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lixi559[使用道具]
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对啊,我也是刚刚接触,用多大频率?另外,是不是时间不能过长啊?
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yychen[使用道具]
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见cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/15146637')
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babybabe[使用道具]
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要破大肠用不着超声也行的吧。
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