蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】提取细胞总蛋白频频失败！

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 11  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】提取细胞总蛋白频频失败！

nut6694[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74107
精华 1
积分 464
帖子 583
信誉分 102
可用分 3723
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
1

发表于 2014-1-14 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】提取细胞总蛋白频频失败！


近来提取细胞总蛋白频频遭遇失败，虽然实验方法与以前成功提取时是一样的：
冰PBS洗涤三遍，
胰酶消化后冰PBS收集细胞，1600rpm离心6分钟，去上清
加入RIPA裂解液100ul及PMSF1ul，4度过夜
1,2000rpm离心15分钟，移上清于EP管
以上操作均在冰上进行。
在最后一次离心后，管内几乎都是核酸样物质(透明粘稠)，几乎没有上清液。非常奇怪！
不知道怎么回事，请大侠们帮忙分析一下吧！
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
2

发表于 2014-1-14 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
见粘稠的液体，可能是你的RIPA量加少了，可适当加大其量，我们一般都是加RIPA后冰上裂解30分钟，效果还可以。
祝实验顺利！
顶部
TAT[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74236
精华 0
积分 507
帖子 694
信誉分 100
可用分 4298
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
3

发表于 2014-1-14 22:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 nut6694 于 2014-1-14 22:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

近来提取细胞总蛋白频频遭遇失败，虽然实验方法与以前成功提取时是一样的：
冰PBS洗涤三遍，
胰酶消化后冰PBS收集细胞，1600rpm离心6分钟，去上清
加入RIPA裂解液100ul及PMSF1ul，4度过夜
1,2000rpm离心15分钟，移上清于EP管
以上 ...

同意楼上意见
1、第一次离心可以加大转速至3000rpm，10min。
2、裂解时可以冰上裂解30min，十分钟吹打一次。
good luck.
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
4

发表于 2014-1-14 22:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 nut6694 于 2014-1-14 22:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

近来提取细胞总蛋白频频遭遇失败，虽然实验方法与以前成功提取时是一样的：
冰PBS洗涤三遍，
胰酶消化后冰PBS收集细胞，1600rpm离心6分钟，去上清
加入RIPA裂解液100ul及PMSF1ul，4度过夜
1,2000rpm离心15分钟，移上清于EP管
以上 ...

我也遇到相同问题，用细注射器反复吹吸后溶液可变澄清，但是还是没检测出核蛋白。
顶部
PPT[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75223
精华 0
积分 248
帖子 195
信誉分 100
可用分 1776
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
5

发表于 2014-1-14 22:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
近来提取细胞总蛋白频频遭遇失败，虽然实验方法与以前成功提取时是一样的：
冰PBS洗涤三遍，
胰酶消化后冰PBS收集细胞，1600rpm离心6分钟（可以考虑加大转速，4000转也不为过），去上清，（我一般PBS洗两到三遍）
加入RIPA裂解液100ul及PMSF 1ul（够么？多少细胞？10cm皿，我一般用400-500ul，摇床中进行裂解，除了PMSF我还会加入cocktail，抑制蛋白降解。），4度过夜(我一般放置于冰上30min)
1,2000rpm(我用14000rpm,不过差别不大)离心15分钟，移上清于EP管
以上操作均在冰上进行。
在最后一次离心后，管内几乎都是核酸样物质(透明粘稠)，几乎没有上清液。非常奇怪！
不知道怎么回事，请大侠们帮忙分析一下吧！
顶部
PPT[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75223
精华 0
积分 248
帖子 195
信誉分 100
可用分 1776
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
6

发表于 2014-1-14 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到相同问题，用细注射器反复吹吸后溶液可变澄清，但是还是没检测出核蛋白。

=====================================================

注射器反复抽吸，只是将未消化的组织打散，对于蛋白提取无益！
顶部
glass[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76223
精华 0
积分 715
帖子 1109
信誉分 100
可用分 6373
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
7

发表于 2014-1-14 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我都是一个小培养瓶，25cm2的，加入100ul裂解液，没有试过cocktail，因为觉得以前用PMSF也是一样可以提的很好。现在突然变成这样，真是晕头转向，打算加大离心转速/减少裂解时间再次尝试一下！
顶部
jingling845[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103462
精华 0
积分 330
帖子 380
信誉分 100
可用分 2671
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
8

发表于 2014-1-14 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得你可以考虑用细胞刮刀冰上操作试试，你上述的4度过夜，我觉得很有可能是问题的关键，缩短时间在冰上操作最多半小时，其实说实话，如果没有特殊要求，而且提来的蛋白是短期内就要用的，就只加PMSF就可以的，这点你放心是没有问题的，如果你要长期保存你所的蛋白，蛋白酶抑制剂种类越多越好。
顶部
mickeylin[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79369
精华 0
积分 461
帖子 582
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
9

发表于 2014-1-14 22:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以考虑平皿养细胞，长满后冰上预冷后PBS洗三遍吸净残余液体，冰上操作加裂解液后停留40min，期间晃动几次平皿，细胞刮子刮下液体，4度13600离心20min即可。我一般六孔板加70微升的裂解液。
顶部
linlinstar[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108879
精华 1
积分 329
帖子 293
信誉分 102
可用分 2191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
10

发表于 2014-1-14 22:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
头痛
提蛋白时加多少裂解液，确实很头痛，用25cm2的培养瓶，细胞也有多少之分，个人感觉小分子的蛋白要求不高，大分子的蛋白对裂解液用量要求较高，太少细胞裂解不充分，太多蛋白浓度过低，建议大家都来讨论一下自己的经验，共同学习！！
顶部
 11  1/2 12››