【求助】WB中怪问题：MARKER转到膜上了，但膜上无蛋白？

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标题:【求助】WB中怪问题：MARKER转到膜上了，但膜上无蛋白？

applebook=213[使用道具]
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发表于 2014-1-15 22:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近在做WB，目的蛋白分子量80KD ，用5%浓缩胶，10%的分离胶，用70V在浓缩胶中跑30min左右，120V在分离胶中跑70min左右，电泳中MARKER跑的很漂亮，条带也很清晰。用Bio-rad的电转仪，全湿转，恒流105mA,3-3.5小时后，预染MARKER明显转到0.45uM的PVDF膜上，条带清楚。胶考染无蛋白，也无MARKER残留，但可见较弱的电泳通道，但膜用立春红染色不见任何蛋白，孵抗体后也不见荧光，（二抗和发光剂都没问题）。
在相同条件下用样品做电泳后胶的考马染色，在MARKER标记的70--100KD处有蛋白带。
转膜液没有配错，且是新配的。做了2次都是同样的结果，不知道自己是哪里出了问题，郁闷中，望各位指教！
谢谢啦！

applebook=213[使用道具]
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发表于 2014-1-15 22:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、用Bio-rad的电转仪，全湿转，恒流105mA,3-3.5小时
时间稍有点长，三个小时就可以。
2、胶考染无蛋白，也无MARKER残留，但可见较弱的电泳通道
再次证实转膜有点过，一般考染多少会有点残留。
3、但膜用立春红染色不见任何蛋白
1）转过到滤纸
2）丽春红是不是好用，另外不是染不出就没有蛋白，我们有时候也染不出但是后续照样可以出条带。
在排除了二抗的问题（一般不是二抗的问题）后最大的可能就是一抗，建议不同稀释比在孵育看看。

HP007[使用道具]
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发表于 2014-1-15 22:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哈哈，我的问题和你正好相反。我的样品转的还行，就是看不到marker！郁闷ing。
据我的经验，看看你的夹子是不是很紧，也可能转过了。

nn255[使用道具]
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发表于 2014-1-15 22:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

会不会是蛋白不存在，或者提取的问题或者裂解的问题？

ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2014-1-15 22:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是否膜与胶间有气泡产生,造成蛋白没有转到膜上.

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发表于 2014-1-15 22:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做个阳性对照试试吧。。。

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发表于 2014-1-15 22:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同时跑两块胶,一个转膜，一个直接染色，确定一下是哪个环节有问题。从描述中看，MARKER转的很好，胶上也没残留，会不会是蛋白样品浓度不够或其他原因呢？

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发表于 2014-1-15 22:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一点建议：
1、建议Bio-rad的电转仪，半干转18分钟。
2、根据以上条件分析，很可能转过，小窍门：如果还用你的条件，建议转膜用2-3张膜，这样，即使转过了，第二张，第三张膜可能还会有你的条带。
GOOD LUCK

misswu61[使用道具]
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发表于 2014-1-15 22:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议使用western blot marker进行试验，可检验转膜效率和后续的wb操作所有的步骤是否存在的各种原因。
1.如转膜效率较低或失败，western blot marker不能显色或条带不明显
2.如一抗失效（或无抗原）、二抗没有问题、整个wb操作无问题责，western blot marker显色清晰，但无目的条带。
3.如western blot marker显色不清晰或无条带，责二抗或显色液出现问题
cuturl('http://www.haigene.cn/rapid_western_kit.html') （国内最好的western blot marker）

附件

2014-1-15 22:41

67070386.jpg (15.9 KB)

兔唇[使用道具]
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发表于 2014-1-15 22:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的经验是不能用预染Marker的条带来判断转膜效果！！！
我做过预染marker的转膜，在100v（200-300mA）条件下，只转了5-10min就可以看见所有“Marker”的条带（20k-100k）被转到PVDF膜上，而且非常漂亮，此时胶上已经没有Marker了。对于100k的大分子量蛋白而言，转膜速度不可能这么快的。同样条件下继续转膜，大概1h后，预染marker还是在PVDF膜上。
所以我认为，预染marker由于已经和染料结合，其转膜的情况和我们的目的蛋白是不一样的，预染Marker更容易转到膜上，而且不容易穿透PVDF膜。
不能因为看到预染Marker转到膜上就认为目的蛋白也已经转到膜上！最终还是要对胶和膜进行染色验证。

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