【求助】表达出的多肽变大，非常疑惑

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标题:【求助】表达出的多肽变大，非常疑惑

mercedes[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

向有经验者请教：
我最近在Rosetta（DE3）中用IPTG诱导表达了一多肽，分子量为8.1K
D，但跑Tricine-SDS-PAGE后，位置明显靠后，不在8.1kD位置，在13kD左右，跑了好多次都是这样。
第一次上样缓冲液中没有加SDS，位置不对，后又加了SDS后位置仍然不对。肽中不含二硫键，N端有一His-tag，会是His-tag的原因吗？有文献报道说，His-tag会使表达的蛋白/多肽分子量比实际大5-10kD。有没有可能终止密码子通读？但即使通读了质粒上还有终止密码子，加起来也只有10kD。
迷惑中，z真诚请有经验的高手指教，谢谢!
图中，从左到右各泳道分别代表空质粒未诱导、空质粒诱导4h、1号菌未诱导、1号菌诱导4h、 2号菌未诱导、2号菌诱导6h

附件

2014-1-15 23:03

55859475.jpg (14.77 KB)

newway[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们做的时候也遇到情况了，，，你看一看中国农大袁明教授的一篇文章有所解释，，一篇关于Arabidopsis MICROTUBULE-ASSOCIATED PROTEIN18
Functions in Directional Cell Growth by Destabilizing Cortical Microtubules
The Plant Cell, Vol. 19: 877–889, March 2007, cuturl('www.plantcell.org') ª 2007 American Society of Plant Biologists

小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 newway 于 2014-1-15 23:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们做的时候也遇到情况了，，，你看一看中国农大袁明教授的一篇文章有所解释，，一篇关于Arabidopsis MICROTUBULE-ASSOCIATED PROTEIN18
Functions in Directional Cell Growth by Destabilizing Cortical Microtubules
The ...

哪个地方有解释？能说明白点吗？

mercedes[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

谢谢，一定好好看看。我也希望多出的两条带是我要的东西，但师兄在毕赤酵母中表达的带位置就很正确，硬着头皮往下做做试试，希望自己好运，也谢谢你啊。

mercedes[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 小鱼鱼 于 2014-1-15 23:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哪个地方有解释？能说明白点吗？

就是我表达的肽的位置不对，滞后了，应该8kD左右，但Tricine-SDS-PAGE显示位置在13kD左右，你有什么高见？请赐教，谢谢

小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在问newway 呢，关于表达条带位置的问题，他说那篇文章里有解释，我想问问他，什么地方有解释，不知道你看了文章没有？
我大概看了一下，发现一张电泳图，是 GST 融合蛋白与切除 GST 以后的蛋白质电泳条带。我认为这张图不能解释你的问题，所以我想问问他，到底哪个地方有解释。

bluelake[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主，不知道你是用什么质粒表达的，建议详细看看目的基因插入位点，是不是有一段载体蛋白，包括你his-tag，一般小分子蛋白电泳分子量不会差距那么大。
另外，你的Tricine-SDS-PAGE做的真好，2.5K的marker都是清晰的一条带，能不能给发个详细的方法步骤，让我学习学习？

mercedes[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 小鱼鱼 于 2014-1-15 23:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我在问newway 呢，关于表达条带位置的问题，他说那篇文章里有解释，我想问问他，什么地方有解释，不知道你看了文章没有？
我大概看了一下，发现一张电泳图，是 GST 融合蛋白与切除 GST 以后的蛋白质电泳条带。我认为这张图不能解 ...

在第二页就有解释啊，差的更大

mercedes[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 bluelake 于 2014-1-15 23:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，不知道你是用什么质粒表达的，建议详细看看目的基因插入位点，是不是有一段载体蛋白，包括你his-tag，一般小分子蛋白电泳分子量不会差距那么大。
另外，你的Tricine-SDS-PAGE做的真好，2.5K的marker都是清晰的一条带，能不能 ...

我用的是pET28a，就是加上载体蛋白后应该是8kD左右，愁人啊！我也是刚做Tricine-SDS-PAGE，配方也是参照园子里的帖子配的，主要是仪器好，伯乐的电泳仪非常好用

ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一，你师兄在毕氏酵母中表达的质粒和你用的是同一个吗？
第二，如果不一样，你可以看看你的质粒图谱

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