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标题:【求助】咪唑会影响蛋白质活性吗？

菠萝喵[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】咪唑会影响蛋白质活性吗？


现在我的实验是用镍纯化柱来纯化带有His-tag的脂肪酶，并且需要保留它的活性进一步做酶学性质分析。我用的是GE的HisTrap HP的5mL柱来纯化，按照柱子的说明书在配制洗脱缓冲液里加了500mM的咪唑。但纯化出来点显色平板观察发现只有稍微变色，说明活性不是很高。
所以想问一下咪唑会不会对蛋白的活性产生影响？
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BUK[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不会，可能是你反应体系中蛋白含量低，另外注意纯化温度
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发表于 2014-1-15 23:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看看你的标签是不是对你的活性有影响！ 我一般是最后将标签切下去，最后用buffer或去离子水洗自己的蛋白！
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菠萝喵[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上两位。
做酶学性质前是不是还要将纯化的蛋白透析，除去咪唑一类的东西，这样才比较好？
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hustwb[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你过个凝胶柱子，能除去杂蛋白和更换缓冲液~~
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yysr238[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该不会。
我们实验室纯化蛋白质制作抗体的时候，HIS tag，镍柱纯化，洗脱目的蛋白时的咪唑浓度为500mM。
如果要做酶学分析，还是想办法去除一些不必要的成分吧，酶学试验会受很多方面的影响，稍微有些条件不合适，也会影响酶学活性。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

影响 不是太大 但最好还是去透析掉
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做酶首先要注意低温，保证蛋白的活性，从破碎那一步开始就要完全低温操作，最后要透析除掉咪唑，最好还加点EDTA,避免有金属离子存在使蛋白失活。
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奇蒙kate[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
影响酶活性的因素是很多的!!你的咪唑洗脱产物直接测酶活是不可能得到正确的酶活力数据的,只能的粗略的知道洗脱产物是否有活性酶蛋白质的存在,最终酶活力的检测必须要把杂质(咪唑,盐离子等)去除掉,在适合酶活性的最适pH,最适盐离子及其最适浓度还有辅因子等因素存在下,特定温度时的酶活力数据才能够知道!!你的检测最多只能作为定性的结果来参考!!
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dreaming[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
通常不会，建议你还是过个脱盐柱更换一下缓冲液。另外是不是已经确定获得了目的蛋白？
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