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标题:【求助】原核表达扩大培养问题

XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达扩大培养问题


我做三个蛋白的原核表达纯化，我每次是将上次冻存的菌液扩大培养 100ul接种到5ml LB 中，后然后接种到500ml LB 培养基中，这样时间久了质粒会丢失吗？为什么我一个月前还好好的菌株怎么现在就不表达了呢？小菌量诱导有目的条带 但是不是很浓，老板催结果，很急 希望各位高手能给点意见，歇息。
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
质粒不会丢失，但是菌的活性会受影响。你可以把质粒提取出来重新转化，然后再诱导蛋白。
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=pkchen=[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

菌体冻存时间长，使用时最好在平板活化一下
祝 顺利
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有时候不妨不试试几个菌，同时转化的有些很好诱导，有些诱导不出来。
好运~
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在培养的时候一定要保持压力，没有压力细菌很容易把质粒排除出去，这东西对他是一个负担的。
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glass[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做三个蛋白的原核表达纯化，我每次是将上次冻存的菌液扩大培养 100ul接种到5ml LB 中，后然后接种到500ml LB 培养基中，这样时间久了质粒会丢失吗？为什么我一个月前还好好的菌株怎么现在就不表达了呢？小菌量诱导有目的条带 但是不是很浓，老板催结果，很急 希望各位高手能给点意见，歇息。

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你的问题在于将上次冻存的菌液进行活化的原因吧？这样很容易表达量降低。我们一般是涂平板、挑单克隆、筛选高表达菌株并以甘油菌形式保存后，每次取分装的甘油菌进行活化。
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小螺号[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
菌种保存不当表达量会降低甚至不表达，建议提质粒来保存。重新转换，挑单克隆。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

筛选一下，同时建议你看一下pET系统中文表达手册，参照一下里面的方法。考虑按筛选毒性基因的方法进行试验
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u234[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
活化一下吧
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Ao7[使用道具]
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发表于 2014-1-15 23:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
菌种保存不当表达量会降低甚至不表达，建议提质粒来保存。重新转换，挑单克隆。

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正解
身边很多用冻存菌做不出来的，重新转化就没问题了
翻开任何蛋白表达教科书，都是要新鲜转化。gold rule！
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