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标题:【求助】SDS-PAGE条带异常（带图片，已采取3个解决方案）

kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-1-16 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE条带异常（带图片，已采取3个解决方案）


上周碰到了SDS-PAGE分离异常的问题，分辨率极低，且胶的下部基本无条带。考虑到新更换了下胶缓冲液和丙烯酰胺，故分别对这两种溶液进行了重新配制。结果均未能改变异常情况，说明不是操作配置失误的问题。综合分析原因，将该异常现象归为试剂质量问题， 故更换Tris碱与SDS，从新配置下胶缓冲液，电泳结果仍异常。下一步考虑更换电泳仪器，再行尝试。还没有看到结果。
请各位大侠帮助分析分析。


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yychen[使用道具]
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发表于 2014-1-16 20:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 kewanqi2011 于 2014-1-16 20:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

上周碰到了SDS-PAGE分离异常的问题，分辨率极低，且胶的下部基本无条带。考虑到新更换了下胶缓冲液和丙烯酰胺，故分别对这两种溶液进行了重新配制。结果均未能改变异常情况，说明不是操作配置失误的问题。综合分析原因，将该 ...

你的样品是什么呢？之前这个样品有没有跑过电泳的？情况是不是一致？你跑的是还原胶还是非还原胶？
从你的结果看我觉得可能是样品的问题，是不是在上样孔有很多的蛋白没跑下来呢？我之前做复性时常会有这样的情况，你可以换一个其他的蛋白样品（最好是之前做过电泳的）进行电泳，如果正常则可以排除试剂和仪器的问题啦，希望对你有帮助。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-1-16 20:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yychen 于 2014-1-16 20:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


你的样品是什么呢？之前这个样品有没有跑过电泳的？情况是不是一致？你跑的是还原胶还是非还原胶？
从你的结果看我觉得可能是样品的问题，是不是在上样孔有很多的蛋白没跑下来呢？我之前做复性时常会有这样的情况，你可以换一个 ...

谢谢回复啊！样品问题也排除过（附图），图1左起1、3、4泳道均在这张图中跑过，前后隔了个周末。


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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-1-16 20:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
已经换过仪器，问题仍然存在。
想来想去，有点像是TEMED或是APS的原因，不然胶的分辨率怎么会这么低？
聚合不均匀？？？
但是聚合剂一直使用，并未更换过，从来没有碰到过SDS-PAGE的问题超过一周都没能解决的时候。。。。。。
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发表于 2014-1-16 20:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #4 kewanqi2011 的帖子

做电泳时浓缩胶正常吗？样品条带能否被压缩？看图应该与样品无关，marker也跑不好。我觉得应该检查tris-甘氨酸电泳缓冲液以及配胶缓冲液的pH值。还有看看药品柜里的试剂是不是有误，最好自己亲自动手把所有的试剂重新配制一遍。检查pH计有问题没有。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-1-16 20:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 大海啊故乡 于 2014-1-16 20:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做电泳时浓缩胶正常吗？样品条带能否被压缩？看图应该与样品无关，marker也跑不好。我觉得应该检查tris-甘氨酸电泳缓冲液以及配胶缓冲液的pH值。还有看看药品柜里的试剂是不是有误，最好自己亲自动手把所有的试剂重新配制一 ...

谢谢回复！最近实验终于回归正常，刚顾上上来汇报。
1. 浓缩胶、分离胶的pH正常，电泳时样品在浓缩胶能被正常压缩。
2. 试剂质量前面已经有怀疑，且更换过，未能改善。
3.进而怀疑所用试剂或缓冲液有污染，如上胶Buffer、电泳缓冲液、TEMED；或者丙烯酰胺新鲜配置后未过滤。
由于实在是没有一个比较倾向性的原因，加上时间耽搁不起，我们将所有的试剂包括电泳缓冲液借来一套，进行排查。最终最终。。。。。。
问题出在了电泳缓冲液，换成借用的电泳缓冲液，电泳恢复正常！
那原因是什么？现在还没来得及排查，前面提过我们只是更换过下胶缓冲液和丙烯酰胺后电泳就出了问题，电泳缓冲液并未更换过。暂时猜测是我们重复使用的下槽电泳液受到了污染。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-1-16 20:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

当时为了的防止pH计出问题，上、下胶的缓冲液都分别用pH试纸测过。因为知道电泳异常常常是忘记调缓冲液pH或者盐酸失效，加入过多cl离子导致的。APS失效的问题也碰到过，总觉得该是老手了，可还是会栽跟头：）
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kewanqi2011[使用道具]
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 小中大

观察电泳缓冲液，发现有团状菌体，推测是这个原因导致分辨率降低。
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