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标题:【求助】如何提高 Mascot 检索成功率

any333[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何提高 Mascot 检索成功率


如何提高 Mascot 检索成功率
我的是棉花，基因组没有测定
很多差异点都找不到比对
怎么办啊
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
棉花虽然不是属于模式生物，但也不属于很稀奇的物种，以植物总库，或者拟南芥库进行检索，大部分（90%）的蛋白应该都是可以鉴定的，你的差异点鉴定不成功，原因可能有三个，蛋白不纯或者量不够（如果是考染双向电泳，估计这个不是主要问题），质谱没有做好（可能性比较大），搜索参数设置错误（如果是公司做的话，这个应该没有问题）。以上意见仅供参考，你可以酌情考虑！祝实验顺利！
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any333[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
质谱是在一个师兄他们那做的
但是没有帮我检索。他说质谱做的都很好
我的是先用pro-Q 磷酸化染色，照相后
用blue silver 染色。这是是不是造成了
一些不可预知的修饰啊，后者质谱还需要
处理。此外我不指导Mascot 一些设置的具体意义
比如MH+ M MH- 如何选择
Monoisotopic 与 Average 又有什么区别
此外我怎么把picklist 里面的数据拿出来做profound
（听说这个碧mascot好）
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实我也不是专业做质谱的，所以对具体的一些操作和参数也不是很清楚，我的质谱都是交给公司做的！
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tie8[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.用NCBI的nr全库。
2.放宽搜库的参数范围：包括母离子误差、碎片差、漏切数目等
3.降低confidence，如到90%
4.依据所使用的质谱仪器，适当修改搜库的参数
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发表于 2014-1-18 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
质谱是在一个师兄他们那做的
但是没有帮我检索。他说质谱做的都很好
我的是先用pro-Q 磷酸化染色，照相后
用blue silver 染色。这是是不是造成了
一些不可预知的修饰啊，后者质谱还需要
处理。
这个你可以看看相关文献，估计影响不大。
此外我不指导Mascot 一些设置的具体意义
比如MH+ M MH- 如何选择

=======================================================================================

这个要看你做质谱时选择的离子模式，是正离子还是负离子还是不带电荷的，通常是正离子模式，那么就选择MH+。
Monoisotopic 与 Average 又有什么区别
前者应该是可以区分同位素峰，后者是取平均质量数，这个要看你的蛋白质性质和质谱结果而定了。
此外我怎么把picklist 里面的数据拿出来做profound
（听说这个碧mascot好）
profound没用过，mascot也不错啊。
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any333[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果我想用profound
有没有什么技巧
此外放宽条件后检出的可靠吗
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any333[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.用NCBI的nr全库。
2.放宽搜库的参数范围：包括母离子误差、碎片差、漏切数目等
3.降低confidence，如到90%
4.依据所使用的质谱仪器，适当修改搜库的参数

=====================================================

请问
4的几个数据库个人感觉MSDB NCBI 却别不大，swiss的感觉数据少
可以把3的设置全部设为可变的1位吗
第1位的最好怎样设置啊，有人建议用100ppm,或者0.02-0.05%
这几个的区别在哪
谢谢


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发表于 2014-1-18 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4的几个数据库个人感觉MSDB NCBI 却别不大，swiss的感觉数据少
我的感觉用nr就行
可以把3的设置全部设为可变的1位吗
这个是按照你实验的步骤设置的，一般固定是Cys烷基化，可变是M的Oxidation，如果你进行了这两个修饰就选这两个
第1位的最好怎样设置啊，有人建议用100ppm,或者0.02-0.05%
这几个的区别在哪
这个看你用的是MALDI还是LTQ或者其他类型的质谱仪？MALDI的话母离子是0.2Da，碎片是0.3Da
漏切可以改为2
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发表于 2014-1-18 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最简单靠谱的方法：找棉花cDNA库做成Mascot库搜索（可以找北大朱玉贤实验室合作，他们号称棉花基因库最全）。
如果不行，通过跨物种检索也可以，但切记 只能使用MS/MS检索，PMF是不能跨物种检索的（假阳性非常高）。
MS/MS跨物种检索搜不出来也是很正常的，因为只有正好做到保守序列才能鉴定成功，十分看人品。
要提高成功率，正确的做法是提高质谱测定质量（即拿到信噪比高的谱图，尽量保证质量准确度高），然后提高Mascot检索设置参数（提高MS质量准确度(<20 ppm)，提高MS/MS质量准确度(<0.2 Da)）。降低MASCOT检索参数或许可以得到一些鉴定结果，但并不可靠。
最新的MALDI-TOF/TOF可以做到5 ppm质量准确度，非常适合这类应用。
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