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标题:【求助】Ni柱纯化蛋白如何提高结合率？含图

chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Ni柱纯化蛋白如何提高结合率？含图


如下图，我用的是novagen的His bind resin，没有过柱，按照操作手册上的方法在EP管里进行小批量的纯化，在4度翻转结合了1h，这里的上样量大约相当于500ul的菌液。从这个图的结果来看，似乎大部分蛋白都没有结合上ni柱，请问要如何解决这个问题？？我的结合、漂洗、洗脱溶液的咪唑浓度分别是10mM、60mM、1M，好像很多蛋白在漂洗阶段就被洗下来了，要怎么办呢？看到有帖子推荐用不同的咪唑浓度进行梯度洗脱，这样有什么好处？我直接用1M的咪唑浓度理论上应该是都洗脱下来了啊，有必要做梯度吗？请多多指教！！


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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一个问题，我的目的蛋白底下还有杂带，怎么除去这些杂带呢？因为我的蛋白为了助溶在N端还接了GSTtag，整个蛋白70多KDa，是不是发生了断裂啊？
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看上去那个 1600 ng 的洗脱条件不错啊。
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 yjf1026 的帖子

啊，我没说清楚，中间那几个XXX ng是我上的BSA，用于定量
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glass[使用道具]
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发表于 2014-1-18 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉表达不是很好嘛。。你那目的条带在啥位置哇？应该在MARKER的哪个位置啊？
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-1-18 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 结合的时候加大样品与resin的比例（使用10ml菌液）。
2 漂洗咪唑浓度太高了，建议从20mM开始洗涤。100、200、 500mM进行洗脱，同时检测你的目的蛋白。这样同时可去除不必要的杂代。
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-1-18 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
表达量太低，建议做免疫印迹检测一下是否有表达。在有表达的前提下，可以加大菌液量与填料的比例再试试吧？
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2014-1-18 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先确定有效表达，其次再来做纯化
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langlang[使用道具]
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发表于 2014-1-18 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

500ul菌液太少了！建议1mL 菌液，收菌后溶到100uL lysis buffer中，与20uL填料结合，结合时间一般10min足够。lysis buffer 不要含imidazole，然后按50 100 200 300 400 500mM imidazole的梯度洗。提高pH和上样量有助于提高结合能力。有杂带的话考虑下一步纯化吧。
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-1-18 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目的条带就是箭头指的那条！
我实际操作中是将35ml的菌液用bind buffer 重悬，加入溶菌酶、超声，然后和70ul的resin 结合1h的。所以大概是 1ml 菌液：2ul resin的比例，加大比例的话是指多用一些菌液吗？
我的蛋白是有表达的，用wb 也已经检测到了。可能可溶蛋白产量确实不高，不知道大家有什么高招提高表达量呢？
liuaishan 说“lysis buffer 不要含imidazole”，为什么？如果我不用bind buffer来重悬的话，裂解液在纯化时要怎么换成bind buffer呢？还是说不用换？
感谢诸位的指点！！
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