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标题:【求助】请教关于组蛋白western的问题

王薇薇安[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教关于组蛋白western的问题


不知做组蛋白western很有心得的高手能否指导一下。本人参照abcam的Protocol酸提取组蛋白，再用15％sds-page跑电泳，做western。结果很不稳定。不同批次处理的样品做出来的结果不同，一批结果很好，而有些批根本连H3内参都出不来。所以想请教一下，a 酸提取组蛋白时，有那些步骤是关键的，关系着样品提取的成败；b western的过程中，是否有特殊的地方。
谢谢了！
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Ao7[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我也在用酸提取法提取组蛋白，因蛋白最后溶于HCl偏酸，与上样buffer混匀后溶液变黄，请教你怎么处理？我用NaOH调回蓝色，但是考染仍然没有条带。
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教：组织跑western为什么杂带很多，不好出结果？
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王薇薇安[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在用酸提取法提取组蛋白，因蛋白最后溶于HCl偏酸，与上样buffer混匀后溶液变黄，请教你怎么处理？
这个可以直接跑电泳，不用调成碱的。一般我用银染，或western。考染估计量少了
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seagate[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你直接用buffer后变黄的样本电泳是吧，我下次试试看。
另外，我还有一个问题请教一下，我这段时间用RIPA提取总蛋白来做wb，总是没有结果。考虑原因：
1.是不是总蛋白中组蛋白浓度较低导致H3没有条带？
2.100V恒压至溴芬蓝跑到分离胶下三分之一处，染胶发现17KD以下蛋白较弥散，不像分子量较大的蛋白一条一条的那么清晰，转膜后丽春红染色17KD以下位置很淡，考虑可能跑胶出现问题。园子里搜索发现很多战友染胶小分子蛋白位置都有这种现象，想问问你是否也出现过这种现象？怎么克服？
做了几个月了，一直没有结果，心里很着急，谢谢！
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王薇薇安[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我倒是没用RIPA提取过组蛋白，因为其结构的特殊性，建议还是用酸提取法吧；
组蛋白很多是17KD左右的蛋白（H3、H2B），因此我认为条带看似弥散能解释，只要你western后条带单一就行；
我做H3的western转膜条件，10平方厘米膜，10mA，20min~30min，比较稳定。
这只是我的经验之谈，如有不妥请包涵，关键还是自己试试。
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王薇薇安[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充一点，抗体一定要好抗体。血的教训
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发表于 2014-1-19 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那我还是用酸提取法再试试，可是总感觉按abcam的protocal提出来的组蛋白浓度很低，上次定量只有0.5ug/ul，您怎么解决这个问题？最后一步少加点0.2N HCl？
PS:书上说样本经buffer处理后变黄是太酸，需要NaOH调成碱性，否则会反向电泳呢。
我用的abcam的抗体，免疫荧光都有表达，Wb就是做不出来,应该不会是抗体的问题吧？
你用的是半干转吧，我们是biorad湿转，200mA 1h，转完膜胶上目的位置都还剩蛋白。
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发表于 2014-1-19 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提出的组蛋白的浓度确实低，但是western我还是能做出明显的条带，我用的是upstate 的抗体(ChIP 级)；
因为实验室的老师长时间做蛋白提取和纯化，他们的经验是加buffer后因酸变黄对电泳没影响，我是实践也是这样；
我也遇到过能做免疫荧光OK，但western做不出来的抗体。这种情况，如果你完全相信你自己的样品，就只能换抗体了；
组蛋白提取时，请新鲜配置试剂，虽至今没想通原因，但确实有差别。
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Ao7[使用道具]
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 小中大
新鲜配置试剂，好的，非常感谢楼主，以后有问题还要多多向你学习啊！
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