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标题:【求助】做ERK的WB所有的蛋白用什么裂解液提取

qqshepherd[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做ERK的WB所有的蛋白用什么裂解液提取


如题：做ERK的WB所有的蛋白用什么裂解液提取，我用总蛋白提取试剂盒提取的蛋白做ERK通路，一次也没有成功了，希望做过的大侠们指点一下。谢谢！
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abc816[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

全细胞裂解液就可以，磷酸化都可以做的很好，我用的裂解液是自己配的，不知道你的问题出在哪里，详细说一下吧！
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2014-1-19 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 abc816 的帖子

WB流程
10%,4%的胶
一抗1：250，二抗1：500（二抗其他蛋白也用，效果很好）
转膜一般不用丽春红染色，但孵育其他蛋白抗体，可以做出条带
一抗孵育过夜
ECL显色无明显条带。
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发表于 2014-1-19 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如题：做ERK的WB所有的蛋白用什么裂解液提取，我用总蛋白提取试剂盒提取的蛋白做ERK通路，一次也没有成功了，希望做过的大侠们指点一下。谢谢

==============================

你的问题很可能出现在蛋白提取上
是不是磷酸化蛋白？
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2014-1-19 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #4 redbutterfly 的帖子

我现在总ERK都做不出来，磷酸化的也做不出来，一点影子也没见。
所以请教一下大侠
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发表于 2014-1-19 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qqshepherd 于 2014-1-19 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在总ERK都做不出来，磷酸化的也做不出来，一点影子也没见。
所以请教一下大侠

重新配置裂解液
注意加蛋白酶抑制剂
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2014-1-19 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是试剂盒，蛋白酶抑制剂也是和试剂盒另加的，我准备重新体一次看看效果。现在还有个问题就是同一张膜孵育其他抗体可以做出来。ERK不行，重新定ERK抗体了，回来看看效果 。谢谢你的指点
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发表于 2014-1-19 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qqshepherd 于 2014-1-19 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的是试剂盒，蛋白酶抑制剂也是和试剂盒另加的，我准备重新体一次看看效果。现在还有个问题就是同一张膜孵育其他抗体可以做出来。ERK不行，重新定ERK抗体了，回来看看效果 。谢谢你的指点 ...

不客气
抗体很重要
建议订有信誉公司的抗体
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2014-1-19 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚才做这个抗体的免疫荧光做出来了，二抗和别的抗体公用，也做出来了
看来不是抗体的原因了
还得从蛋白上找原因，你说和转膜时间有关吗？
会不会转膜转过了呢？如果有关，可是ACTIN可以显出来的。
会不会和蛋白表达量有关啊，明天继续做一次WB，看看效果吧。
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#甜#[使用道具]
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发表于 2014-1-19 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我提取用的是浆蛋白的，也在做ERK，看了一些文献，有用浆的也有用总蛋白的，是不是都可以呢？
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