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标题:【求助】Ni NTA关注 挂柱效率的问题

jingling845[使用道具]
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发表于 2014-1-22 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Ni NTA关注 挂柱效率的问题


最近在做一个6 his蛋白的纯化
但是经常性的，只能洗脱到很少的一些蛋白
大部分都在挂柱离心后的上清里面。
我通常挂柱至少30分钟，agitation
6M的盐酸胍磷酸盐缓冲液，PH 7.8
应该和胶没关系。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2014-1-22 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你那柱子是否可以使用重力的方式进行纯化，如果可以用重力的方式的话可能效果还要好点。另外我自己根据纯化的经验配置了一种binding buffer,可以提高HIS的结合效率，对不挂柱和挂柱效率不高的蛋白有特效，也不会增加非特异性吸附，加入的试剂对蛋白有一定的保护作用，不管是变性的还是非变性的都适用，就目前我自己用的效果来说是这样的，如果你愿意试试的话，只要你出运费，我给你发点，当然用后一定要给我个反馈。
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jingling845[使用道具]
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发表于 2014-1-22 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能否可以稍微透露一下你的binding buffer 配方？
你可以短消息密我
因为我不在国内，所以邮寄可能比较麻烦
谢谢了
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发表于 2014-1-22 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

条件不充分啊。胶的体积、种类、样品体积、种类，含量、缓冲液中其他成分等等都没讲明白。
另外，胶是不可以agitation的，只能shake。
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-1-22 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你把pH提高到8.5，搅拌时间增加到1小时试一试。
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jingling845[使用道具]
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发表于 2014-1-22 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的两位
不过我不认同
因为我说过了，胶上没有，而离心后的上清里有大量目的蛋白，
因此肯定不是蛋白过量了
另外agitation是 protocol里的，就是在一个机器上翻转，但是不算太激烈
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-1-22 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是啊，我没有说是蛋白过量了，只是你的条件没有表述清楚，蛋白吸附和所处的buffer体系密切相关。
agitation一般是搅拌的意思，而翻转似乎该用rotation或up and down。
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jingling845[使用道具]
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发表于 2014-1-22 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tangxin_80 于 2014-1-22 16:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
是啊，我没有说是蛋白过量了，只是你的条件没有表述清楚，蛋白吸附和所处的buffer体系密切相关。
agitation一般是搅拌的意思，而翻转似乎该用rotation或up and down。 ...


是啊，我没有说是蛋白过量了，只是你的条件没有表述清楚，蛋白吸附和所处的buffer体系密切相关。
agitation一般是搅拌的意思，而翻转似乎该用rotation或up and down。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-1-22 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 jingling845 于 2014-1-22 16:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


是啊，我没有说是蛋白过量了，只是你的条件没有表述清楚，蛋白吸附和所处的buffer体系密切相关。
agitation一般是搅拌的意思，而翻转似乎该用rotation或up and down。 ...

首先，你还是没有将条件说清楚。
6m 的盐酸胍是什么？盐酸胍溶于水的吗？还是用缓冲配制的？
“然后是脲”表示多少浓度，是水溶液还是缓冲液？
等等......
你的“依次”是什么意思？是用一种溶液后，离心，再换下一种溶液？
如果是这样的话，没有得到目标蛋白就很好解释了。
其一，如果你的盐酸胍、脲不是在缓冲液里的，pH就不对了，在漂洗的过程中，目标蛋白很可能丢失。
其二，你的程序像是一个柱上纯化复性的程序，并非所有的蛋白都适用。实际上，只有很少的蛋白适用于柱上复性。有可能你换成非变性的溶液后，目标蛋白都沉淀的介质上了。
建议：1、用缓冲溶液配制变性buffer，pH计确认pH正确。
2、只用一种变性buffer，或者盐酸胍或者脲。
3、不要用柱上复性程序，全程在变性条件下纯化。
4、每步的离心上清液都留样做SDS-PAGE。
5、镍柱在使用前做一次彻底清洗，平衡缓冲液充分平衡后再使用。
6、盐酸胍对SDS-PAGE有较大影响，透析去除后再电泳。
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