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标题:【求助】蛋白纯化过程中电导的变化

079777chao[使用道具]
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发表于 2014-1-22 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白纯化过程中电导的变化


请教各位战友，蛋白质纯化过程中电导是如何变化的？我目前在做原核表达蛋白的纯化，用的是GE公司prime plus的纯化系统，该系统自带的软件有个电导参数，我做了两次纯化，电导变化是两种情况，不清楚电导应该怎么变化？望各位帮帮忙啊
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2014-1-22 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说明你的缓冲体系有问题
电导与你的缓冲体系中盐浓度有关。
应该是你2次使用的buffer不是一次配制的，配制不准确。
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 小中大
电导反映的是溶液中的离子强度，你说的电导变化指的什么，变化范围多少？
你用的初始溶液配方是否一致，样品预处理过程有无变化，洗脱条件是否改变。
电导值在离子交换层析中是重要的参数，电导值越高蛋白与柱子的结合力越弱，越容易被洗脱下来。疏水层析则是电导越高越容易挂柱，因为要加盐上样，在凝胶过滤层析中没有特别重要的意义。
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079777chao[使用道具]
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 小中大

我是用镍柱做重组蛋白的纯化，共纯化了四个表达蛋白（这四种蛋白都是来源于同一个菌的不同蛋白），上样缓冲液和洗脱缓冲液中只是咪唑的浓度不同，后者高，离子强度是一样的；另外，这四个蛋白纯化时所用的缓冲液都是同一次配制的。
纯化过程中主要通过紫外、电导、温度这三个参数来检测，前三个纯化时电导的变化是：从上样缓冲液开始到洗脱完基本上都是29-30ms /cm范围内波动，到换成水之后就下降到0.02ms/cm左右；第四个蛋白纯化时电导与前三个纯化时的不同之处：电导在洗脱过程中很快下降到4.5ms/cm左右，而后又快速地升到了29ms/cm左右。
电导这样变化说明什么？望各位多多帮忙！谢谢了！
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079777chao[使用道具]
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发表于 2014-1-22 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是没有完全平衡好吧，可能管路中还有少量别的溶液
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发表于 2014-1-22 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第四个蛋白你有重复做一次么？没有误操作？
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dongdongqiang[使用道具]
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 小中大

亲和柱一般不太考虑电导。
溶液体系中不同蛋白对电导的影响也不同，个人觉得亲和柱没必要关注电导的变化，除非你有特殊要求。系统给出的各项参数，未必在所有类型的层析中都要检测。比如电导，在疏水或离子交换中考察更适合。
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发表于 2014-1-22 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
贴图 帮你分析
离子柱走梯度最可能变化
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发表于 2014-1-22 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是用镍柱做重组蛋白的纯化，共纯化了四个表达蛋白（这四种蛋白都是来源于同一个菌的不同蛋白），上样缓冲液和洗脱缓冲液中只是咪唑的浓度不同，后者高，离子强度是一样的；另外，这四个蛋白纯化时所用的缓冲液都是同一次配制的。
纯化过程中主要通过紫外、电导、温度这三个参数来检测，前三个纯化时电导的变化是：从上样缓冲液开始到洗脱完基本上都是29-30ms /cm范围内波动，到换成水之后就下降到0.02ms/cm左右；第四个蛋白纯化时电导与前三个纯化时的不同之处：电导在洗脱过程中很快下降到4.5ms/cm左右，而后又快速地升到了29ms/cm左右。
电导这样变化说明什么？望各位多多帮忙！谢谢了！
我也觉得做亲和层析纯化时不用关注电导值，电导值是在离子交换层析中是重要的参数。亲和层析的优点是可以在高盐的浓度下操作。。所以最好在平衡和洗脱缓冲液中加入0.15-0.5m的nacl，消除一些离子交换作用，降低非特异性吸附。
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dongdongqiang[使用道具]
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 小中大
我是用镍柱做重组蛋白的纯化，共纯化了四个表达蛋白（这四种蛋白都是来源于同一个菌的不同蛋白），上样缓冲液和洗脱缓冲液中只是咪唑的浓度不同，后者高，离子强度是一样的；另外，这四个蛋白纯化时所用的缓冲液都是同一次配制的。
纯化过程中主要通过紫外、电导、温度这三个参数来检测，前三个纯化时电导的变化是：从上样缓冲液开始到洗脱完基本上都是29-30ms /cm范围内波动，到换成水之后就下降到0.02ms/cm左右；第四个蛋白纯化时电导与前三个纯化时的不同之处：电导在洗脱过程中很快下降到4.5ms/cm左右，而后又快速地升到了29ms/cm左右。
电导这样变化说明什么？望各位多多帮忙！谢谢了！
你的电导那样变化最可能的原因是你用水洗柱子后没有，冲系统泵，水还存在于你的管道以及系统的泵内，所以在你洗脱时首先是水进入柱子里面，这个时候电导是下降的，等到管道以及泵内的残留的水洗完后，你换上去的BUFFER开始出来了，这个时候电导就开始上升到你BUFFER的电导值。
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