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标题:【求助】关于PET28a载体的表达

langlang[使用道具]
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发表于 2014-1-24 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于PET28a载体的表达


最近做的载体用的是PET28a的载体，但是用37度试着诱导了却没有目的带。转化的菌种是rosetta(DE3)。不知道原因。能不能帮我分析一下？
是不是需要换个载体？如果需要的话，为什么用PET28a这个载体就诱导不出来呢？
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发表于 2014-1-24 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Rosetta这个菌种我不太熟悉，不过一般诱导都是30度6小时或20度诱导过夜，37度是菌体的最适生长温度，它本身的必需蛋白都来不及合成呢，怎么可能合成外源的对自己生长非必需的一个蛋白呢，建议降低诱导温度
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发表于 2014-1-24 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Rosetta是非常好的一种表达菌株，因为它自身带有了编码稀有密码子tRNA的prare质粒，对于真核细胞蛋白在原核中的表达，非常有帮助。
pet28因为N端带有HIs标签，对于蛋白的表达和纯化都很有帮助，
所以pet28、rosetta的组合是非常好的。
建议你:
首先确定插入的序列是正确的，没有突变，通过测序便可知。
确定使用的IPTG没有失效，可以使用正对照。
然后在摸索在不同OD、不同时间的表达情况。
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langlang[使用道具]
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发表于 2014-1-24 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢~~~我试一下。请问PET28A的标签是多大？
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langlang[使用道具]
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发表于 2014-1-24 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再问一下。有没有可能在序列正确，IPTG没有失效的情况下。总是不能表达呢？？
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发表于 2014-1-24 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢~~~我试一下。请问PET28A的标签是多大？

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这个标签很小，看你是只融合了N端的His还是C端的His也融合了，反正表达出来的蛋白就比你预算的大个几KD （6KD内）。
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发表于 2014-1-24 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 langlang 于 2014-1-24 11:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

再问一下。有没有可能在序列正确，IPTG没有失效的情况下。总是不能表达呢？？

这种情况也是存在的，有些蛋白用一般的表达系统就是很难表达，特别是一些毒性蛋白和膜蛋白等，你首先要分析你蛋白的特点。
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langlang[使用道具]
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发表于 2014-1-24 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这种情况也是存在的，有些蛋白用一般的表达系统就是很难表达，特别是一些毒性蛋白和膜蛋白等，你首先要分析你蛋白的特点。

==============================

我的这个蛋白不是膜蛋白，也没有毒性。
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发表于 2014-1-24 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个标签很小，看你是只融合了N端的His还是C端的His也融合了，反正表达出来的蛋白就比你预算的大个几KD （6KD内）。

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我在PET手册上好像查到his-tag标签蛋白分别有6KD，8KD，10KD。但是我不知道是PET28A是多大~~~能不能有个确切的数据？
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ffaa[使用道具]
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发表于 2014-1-24 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

确切的大小你可以把你插入的序列放到pET28a序列当中，电子翻译一下就知道了，我也不知道你引物是怎么设计的，带了几个标签，所以没法给你确切的答案。
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