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标题:【求助】】western 条带空心 如图

静夜思[使用道具]
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发表于 2014-1-24 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】】western 条带空心 如图


western 最近做的总是不顺利。看图说话吧。
2天前跑了个空心的条带，按照园里一些帖子的建议，我把一抗浓度降低到1：5000（康成），二抗浓度也降低到1：5000，上样蛋白的浓度分别是40ug，和50ug。片子如下。 大家再来给点建议吧，我是不是应该再降低上样量呢？问题是我以前做也是用这个条件，也未出现过空心情况啊。


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静夜思[使用道具]
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发表于 2014-1-24 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还是那张片子，拍的不清楚，主要看一下上面的条带。这张我很奇怪的是：上面条带的第6孔怎么只有那么一点点，像是被挤扁了，是不是因为我这个孔的LB加少了呢？
还有，上面条带的后四个孔，我是有梯度加蛋白的，分别是1、3、5、7ul，但结果看不出有什么梯度呢？


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发表于 2014-1-24 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

估计是一抗和二抗的孵育问题，你使用bsa还是牛奶作为溶液的？
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发表于 2014-1-24 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是奶粉啊，以前也是这样用都没问题，就最近2次这样。
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发表于 2014-1-24 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知你是否重复过？如果排除以上情况，是不是你的膜或胶在空心的地方有问题，比如脏了或胶不小心裂了什么的。如果你的玻板没有搞干净，一定会污染胶，自然转膜也不能转上啦。只是推测哈，待高手解答！
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发表于 2014-1-24 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你上样品时是否也加了loading buffer补齐总体积 ?如果是这样，你是否在孔的中间加入的，这样loading buffer 会把样品中的蛋白质分开。　
建议看看我的WESTERN失败体会：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=14367998&sty=1&tpg=2&age=0')
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静夜思[使用道具]
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发表于 2014-1-24 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复楼上的建议：
1、玻璃板是否干净——以前是用自来水使劲冲，懒得再用双蒸水洗了，这个我下次注意清洗。
2、上样品时是否也加了loading buffer补齐总体积？——是加LB补齐的呀，每个孔加4ul，都是在离心管里混好在上样的。另外，你的失败体会很好，学习了。
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发表于 2014-1-24 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人感觉上样量不用再减小了, 因为出现空心的条带恰恰正是表达量少的条带. 旁边表达量大的条带都没有问题嘛.
不知你在上样之前有没有对上样孔做清理, 就是待电流装置连接完成,电泳液也加好后, 上样之前, 用tip吸取电流液向上样孔中反复吹打几下, 可以清理孔中残留的未凝聚的胶成分. 这样可以使样品上样后更均匀.
此外, 你还可以偿试减小电泳时的电流, 慢慢跑, 这样跑出的条带会更细些.
当然, 你的条带非常清晰, 背景也非常干净, 如果都不行, 再减小一抗或二抗的浓度是没有问题的, 个人认为主要是应该减少一抗的浓度.
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发表于 2014-1-24 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果一抗和二抗都没问题的话，是否是你的转膜有问题呢，会不会有气泡存在呢？请注意一下
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33号[使用道具]
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发表于 2014-1-24 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

至于梯度问题，因为你所做的蛋白表达量很高，而你所选的梯度太接近了。
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