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标题:【求助】抗体电泳，遭遇奇怪情况

purrr[使用道具]
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发表于 2014-1-24 23:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】抗体电泳，遭遇奇怪情况

老同志遇到新问题
原液样品为：杂交瘤上清，单抗
纯化方式为：protein A纯化,纯度在90-95%之间（现有抗体纯化平台做过上千个单抗多抗的纯化）
流穿为：样品流经proteinA柱子后
问题组和正常组，2个不同的项目，但是同一次实验的结果，所以实验条件可以认为相同，电泳为SDS-PAGE变性电泳
问题组的抗体重链，疑似形成大分子聚合物，在分离胶顶部
何故？


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2014-1-24 23:52
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发表于 2014-1-24 23:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老同志遇到的第2个新问题
重组抗体IgG，变性电泳
左边为正常组，右边为问题组，实验条件一样，同块胶跑的电泳
原液为：重组上清
CT为：重组上清过proteinA柱流穿
ab为：抗体
问题组出现一100KD明显杂带，经非还原电泳检测，无IgG外杂蛋白，估计此100KD杂带为IgG来源，或许是重链聚体，或许为重轻链结合物
有没有兄弟姐妹遇到过这样的问题？为什么会产生这样的情况？


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发表于 2014-1-24 23:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一张图不知道正常和异常组的洗脱峰有没有什么区别？
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发表于 2014-1-24 23:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 october7 于 2014-1-24 23:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一张图不知道正常和异常组的洗脱峰有没有什么区别？

GE公司的proteinA亲和填料，洗脱峰都是一样的，单峰，如果去跑HPLC-SEC估计有天然的2聚体存在，但是这个2聚体我们测试过一般5%左右；而第1张图上，重链几乎都是聚成大分子在分离胶的顶部，而且只是重链出问题，轻链很正常，所以不象是天然2聚体的原因
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发表于 2014-1-24 23:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从原液上看不是柱子提纯的问题，更像是抗体的问题，你测抗体的类型了吗
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发表于 2014-1-24 23:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 BUK 于 2014-1-24 23:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

从原液上看不是柱子提纯的问题，更像是抗体的问题，你测抗体的类型了吗

我也觉得是抗体的问题
请问什么抗体类型会出现这样的重链聚合情况？
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 小中大

第1图中
什么原因会导致重链的聚集，而且聚集出来的分子，在常规还原变性电泳中，远大于250KD（从上往下第一条mark），进了分离胶，但是没跑多远……
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发表于 2014-1-24 23:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
自己顶！
现在感觉聚体的可能性居大，因为就算是单体的IgG没有被还原彻底，条带位置也没有那么高，刚进分离胶就走的没多远
聚体有2种可能
1，天然表达的时候，重链就是以聚体的形式表达，而且这个聚体还不易被常规的2-ME打开
2，天然是正常的IgG单体，但是在加电泳loading buffer后，经煮沸5分钟后，重链形成了聚体
，这种情况下，问题的关键就是象2-ME这样的还原剂能把单独的重链还原成多聚体？常理应该是解开重链。
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发表于 2014-1-24 23:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一组的轻链也偏小，你的protein A是新的么？
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purrr[使用道具]
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 小中大


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原帖由 yes4 于 2014-1-24 23:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一组的轻链也偏小，你的protein A是新的么？

轻链位置差不多，基本在25kd附近
proteinA柱子，我们用过以后都用盐酸胍和NaOH 作CIP在位清洗，基本排除杂蛋白的影响
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