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标题:【求助】连接问题

luoliqiong[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】连接问题


菜鸟求助
请教各位大侠
我的目的基因设计的是用NcoI和XhoI酶切，后与pet28a连接后转BL21，涂布卡那抗性平板，好几次都没长，怎么回事啊？
双酶切后我是用胶回收试剂盒回收的，是不是因为回收效率过低影响了连接啊？双酶切后可否直接用乙醇沉淀回收啊？
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回收后跑电泳检测回收情况没有？
还有就是连接时注意载体和目的片段的比例！
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有就是做没做转化的对照！
如有，转化效率有多大？如果效率低的话，你要重新做感受态了啊！
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发表于 2014-1-25 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
双酶切回收后的片段要定量，一般载体片段比插入片段的摩尔浓度比1：3-1：10之间。4度连接过夜可以提高连接成功率
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bring[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
连接产物直接转化BL21吗？好像不太好吧。
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luoliqiong[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是的 我是直接转化BL21，做了对照的，空质粒直接转化的对照，对照可以成功转化，酶切后也跑过电泳的，条带比较亮
哎
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qqq111[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你先转到DH5a中，然后提质粒转到BL21中去。
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