【求助】请大家帮忙看看210，230KD的实验条件！

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标题:【求助】请大家帮忙看看210，230KD的实验条件！

standbyme[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

5%浓缩胶，8%分离胶，80V-120V恒压直至溴酚蓝入水。
湿转250mA 1.5h，（以前做110KD的转70分钟没有任何问题，没做过那么大蛋白的，不知道转膜成功没有，但marker最大170，转过去了的，转膜液不含SDS）
5%牛奶室温封闭2h，一抗CST的，1：1000，4度过夜，37度2h，二抗1：5000. 37度2h.化学发光
问题是就是没有条带，GAPDH很好。实验就耽误在这了，郁闷的很！
我考虑的问题：
1、因为我害怕内参跑没有，所以存在蛋白还没跑入胶的可能，但可能性不大。
2、抗体问题，因为是才买的新抗体，实验室没人做过，但CST信誉很好的，给的图也很漂亮，一条210，一条230，估计可能性也不大。
3、最大的就是转膜的问题，没做过那么大蛋白，转膜时间是不是太短了，看帖子上说大蛋白转膜液要加SDS，没加影响大吗？因为没有做考染，也没办法评价了，还请各位战友帮忙看看条件还有那些需要改进的，尤其是转膜的时间和电流，希望大侠给点经验之谈。谢谢！

avi317[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做270Kd的蛋白，做下来感觉还可以
条件：
1.分离胶6%，浓缩胶4%，先以80v恒压跑25分钟，再以100v跑1个半小时
2.PDVF膜，半干转恒压25v，1小时20分，比较理想
3.转膜缓冲液我是加了SDS的

7437654[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

主要原因还是时间短，分子量太大。
加大时间要是还不行的话电转液里面不要加甲醇，或少加。

guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

推荐半干转湿转有点困难

yonger[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 guagua 于 2014-1-25 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

推荐半干转湿转有点困难

这么大分子量的蛋白半干转什么条件？
我觉得还是湿转好
请教

guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

比常规的半干转延长20分钟足够了其他条件不变

yonger[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 guagua 于 2014-1-25 15:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
比常规的半干转延长20分钟足够了其他条件不变

半干对100K以上的蛋白转移效率欠佳
想问问你的具体条件

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我以前做过3，4个这种大分子的蛋白，感觉转膜很关键
我是湿转，NC膜，电转液含20％甲醇，不含SDS
恒压200V6小时
我不知道楼主提的是什么蛋白，如果是全蛋白，用立春红染色，210左右会有一条比较深的带．我的MARK最大分子量为120，所以这个210的分子量是我的估计数值．

vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-1-25 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.转膜时间太短，我们科的转膜传统恒流80mA，我只知道一个师姐做过250KD的，80mA转7-8h。
2.大分子量的应该加SDS。
3.甲醇可降低到15%
4.“5%牛奶室温封闭2h，一抗CST的，1：1000，4度过夜，37度2h，二抗1：5000. 37度2h.”如果抗体是封闭液配的，可以不封闭试试。
一抗都过夜了，还有必要37度2h嘛？抗体也并非时间越长越好！4度10——12h差不多了吧
我做的条件是二抗25度1h 比37度的效果好。
5.不同实验条件结果可能相差很大，刚开始做实验可以摸个抗体滴度。试着提高一抗，如果都是4度的话，好出的蛋白（例如actin，我用过5次依然出的很好）可以多用几次。
6.抗体要与膜充分接触
如果以上都不能解决，试着适当延长洗膜时间，特别是二抗。有一次ECL显色第一次没出，就把膜放在那接着洗，吃晚饭回来了再撒些显色液就出了。