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标题:【求助】蛋白质老在镍柱上聚集怎么办

yhz1973[使用道具]
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【求助】蛋白质老在镍柱上聚集怎么办


我的蛋白上镍柱老是在柱子上聚集,很难洗脱,用1M咪唑和尿素才能洗脱下来。请问怎么才能不聚集呢?急,求助!
或是推荐些防止聚集的文献也行。多谢!
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moonlight45[使用道具]
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遇到过这种情况,通常即使用高浓度的咪唑洗下来,一会就有沉淀了。这种蛋白不稳定,通常会在透析时候也会有沉淀。 不加NaCl 试试,还有注意你的缓冲液buffer的Ph. 这种蛋白做出来,很难浓缩。我们的蛋白对Nacl浓度变化非常敏感。
能不能详细介绍下你的蛋白情况。
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8princess8[使用道具]
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我的想法:
先分清是蛋白的问题还是镍柱的问题呢?
如果是镍柱的问题,那在其它柱上就不会有类似情况。
如果是蛋白的问题,那在其它纯化柱上也会有类似情况。
是镍柱的问题,换TALON或cobalt。
是蛋白的问题,那就考虑换一种标签试试。
当然也有可能是buffer的问题。
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阿司匹林[使用道具]
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有遇到类似问题的,请留言。介绍点成功经验。其实这种问题很普遍,有点人认为是金属离子使目的蛋白氧化,导致不稳定,建议构建其他Tag的载体。但我没试过,不知道行不行?
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abc816[使用道具]
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其实主要还是对自己蛋白不了解或楼主没说清楚是不是复性后的样品等,大多还是蛋白本身如疏水性强或容易聚合或是pH选择不合适导致沉淀,具体问题具体分析,此外为避免这样的问题,上样的浓度不能过高等等.
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对,是变性后上柱子?还是直接上柱子?希望大家来介绍点成功经验?
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101010[使用道具]
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你标签前面带有蛋白酶位点吗?如果有的话,不妨直接切下来算了。我之前纯化一个转录因子就是这样,洗脱不下来,最后我就直接用蛋白酶把目标蛋白切了下来,用来后续试验。
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98776langtao[使用道具]
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8
 

Probably too much nucleic acids clogged the column. Try to use 0.1% PEI to remove nucleic acids and then ammonium sulfate precipitate your target protein, next dialyze against your his-tag binding buffer and then load onto the column.
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yhz1973[使用道具]
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是表达在包涵体中的蛋白用8M尿素溶了后再上柱的。
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阿司匹林[使用道具]
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Probably too much nucleic acids clogged the column. Try to use 0.1% PEI to remove nucleic acids and then ammonium sulfate precipitate your target protein, next dialyze against your his-tag binding buffer and then load onto the column.

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请问核酸会引起蛋白不稳定? 为什么要用PEI沉淀, 用核酸酶不行吗?为什么要硫酸铵沉淀?能不能解释下?谢谢!
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