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标题:【求助】SDS-PAGE蛋白单条带做质谱不纯

wawa[使用道具]
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发表于 2014-2-3 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE蛋白单条带做质谱不纯


蛋白纯化后，非还原处理后有两条带，分的很开，两条带均有我要的蛋白的活性。
把染色较浅但是活性较强的条带切下做maldi tof 质谱。
我的蛋白是真菌中的木糖苷酶，质谱结果mascot搜索真菌数据库分值很低，只有19，搜其它物种数据库，也都没有超过50.
请教高手，我的单条带如果不纯，有没有可能通过其它质谱，打出我要的蛋白的一段准确序列，然后设计兼并引物，扩增出其基因片段？
我的目的是寻找通过蛋白序列，找到基因。
下面是我的电泳图，第二条带是做质谱的带


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发表于 2014-2-3 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一个问题，你可以尝试多种酶来切，再进行分析，看能不能找到分值高的序列。
第二个问题，木糖苷酶的理论序列应该有吧，你想鉴别的这个不是木糖苷酶吗，有点理解不动你的意思，想鉴别一个蛋白有很多种手段，说的清楚点我才好多说一些！
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发表于 2014-2-3 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 最好不要采用银染，蛋白胶上回收率太低，对新手操作太难，质谱二级谱不容易得到。以你现在蛋白在胶上染色程度，上样量加大2-5倍，用胶体考染应该能出来.(如果样本够的话)
2.要找“准确序列”，只能通过二级谱来确定。
祝好运！
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wawa[使用道具]
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发表于 2014-2-3 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上二位！
我们实验室蛋白做的少，我的蛋白是切胶后送出去，别的单位给酶切和质谱。
我上传的是银染的图，送养的时候用的考染，上面的带考染很清楚，下面的条带可见但不是很清楚。不知这样的样品量够不够要求。
图上最左边的三条带是marker
木糖苷酶的序列也有不少是已知的。我做的目的是从蛋白入手，验证用PCR方法扩出来的序列是不是要的木糖苷酶的基因。
二级谱是指的质谱串联吗？
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ilovegaga[使用道具]
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发表于 2014-2-3 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1．二级就是串联质谱的意思，理论上说，你的想法是很好的，但是肽质量指纹图谱（ＰＭＦ）＋二级图谱所获得的的蛋白序列并不一定就是你所想像的完整的Ｃ或Ｎ末端序列，而很有可能是蛋白当中若干段的序列，所以一旦部分蛋白序列获得之后，你还可能有必要通过其它一些方法获得全长基因序列。
２. 图中银染的的条带蛋白量确实比较少，如果可以有考染的条带应该问题不大了。
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wawa[使用道具]
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发表于 2014-2-3 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果有一段蛋白序列，我想可以通过兼并引物，保守区引物扩出一段序列，再通过genome walking扩出两侧序列得到全长。
这是我送样切胶的考染图，下面浅颜色的是我要的条带，不知这个亮度做串联质谱够不够，是不是条带不够清晰？今天电话咨询军科院的老师，说目的蛋白如果占到100ng就可以做LC MS/MS


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发表于 2014-2-3 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根据楼主的蛋白胶图片，目的蛋白大小如果以１２０KD计算，上样量以10ul计算的话，纯化的蛋白浓度约为0.1pmol/ul, 应该说上Maldi-tof应该是问题不大的，但是我不明白的是你开始说的是maldi-tof，后来怎么又变成了LC MS/MS了？
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wawa[使用道具]
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发表于 2014-2-3 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵，回楼上，开始做了一个马尔蒂-托福，后来发现结果一点用处都没有，想通过LC MS/MS得到准确的片段序列信息
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了了[使用道具]
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发表于 2014-2-3 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 按照PAGE上的量是绝对可以做MALDI-TOF-MS/MS得到序列的（按照本人经验没必要做LC-MS/MS，因为量已经非常够了，且观察图单条带蛋白数应该不会很多）
2. 有一点你需要考虑的是，蛋白库中是否有这个酶的序列。如果没有，就比较麻烦（但是如果有MS/MS图谱，de novo sequencing也可以）
3. 你如果能放上相应条带的质谱图，包括一级谱（PMF）和二级谱（MS/MS）就比较好分析了。
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-2-3 11:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的各位 是否应该考虑一下蛋白本身的问题
或者 从表达过程中DNA序列着手 序列正确 再开始考虑蛋白的精纯
电泳纯 做质谱是有些牵强
可以考虑多部纯化后 收集吸收峰的最高点部分 然后做电泳和modi-tof
要不要电泳切胶 只要纯化的蛋白除盐 浓度够高 可以直接质谱检测
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