蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】WB转膜问题？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】WB转膜问题？

uuooii[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107968
精华 0
积分 363
帖子 345
信誉分 100
可用分 2631
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
1

发表于 2014-2-3 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB转膜问题？


我在做WB，有两个目的蛋白，分子量分别为32kd，36kd，分子量很是靠近，以前我们裁膜的时候由于分子量很接近，所以每次一块胶只能做一个指标，既浪费时间，也浪费试剂，我最近想了一下，可不可以不裁膜，直接将两个目的蛋白放在一起加一抗，然后洗膜，加二抗，不知道这样的方法可不可行，有实验室做过这样的方法，或者有什么好的建议，可否告知！谢谢！
顶部
feima+[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77651
精华 0
积分 424
帖子 547
信誉分 100
可用分 3561
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态 离线
2

发表于 2014-2-3 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以先做表达量小的蛋白
然后stripping一下
做表达量大的蛋白
再stripping
做内参
good luck
顶部
vtongli[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107987
精华 1
积分 283
帖子 221
信誉分 102
可用分 1926
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
3

发表于 2014-2-3 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

完全可以，将两个蛋白的一抗混在一起，一起孵育，二抗也是混在一起一起孵育。
我做的是分子量43kda的蛋白和36kda的内参，就是这样双标的。
但是要注意摸好两个一抗，两个二抗的条件。
举例来说，可能一抗A需要室温孵育2h条带已经很漂亮了，而一抗B可能需要室温4h才可以。
此种条件下，如果按一抗B的条件,一抗A可能是连成一片，过头了。
这时候要，通过调整一抗A的浓度来协调两者的条件统一。
以此类推，二抗。
试试吧，祝好运。
顶部
uuooii[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107968
精华 0
积分 363
帖子 345
信誉分 100
可用分 2631
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
4

发表于 2014-2-3 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

恩，谢谢你们的回答，我们实验室一抗孵育都是在冷库（大致保持在4°左右），时间为一夜，然后第二天回收一抗，洗膜，加二抗。我决定下次做的时候试一下，有结果的话，就贴上来！
顶部
uuooii[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107968
精华 0
积分 363
帖子 345
信誉分 100
可用分 2631
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
5

发表于 2014-2-3 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在有一个问题请教一下，二抗我原来一个指标是1：10000，也就是10ml加1ul。现在我两个指标放一起了，二抗孵育是10ml里面加1ul,还是加2ul，我自己觉得应该加1ul，如果加2ul的话，二抗条件就变了！
顶部
veiwu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 107977
精华 1
积分 513
帖子 662
信誉分 102
可用分 4122
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
6

发表于 2014-2-3 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是加1ul
顶部
bongte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 80083
精华 1
积分 419
帖子 433
信誉分 102
可用分 3071
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-20
状态 离线
7

发表于 2014-2-3 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以试试，但有全黑或出现MARKer的可能。
顶部
ffooll[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73418
精华 0
积分 437
帖子 574
信誉分 100
可用分 3666
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
8

发表于 2014-2-3 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

32KD和36KD完全能分开吧，我的42KD和38KD跑10%的胶都能分开。你的分离胶是不是太短了啊！
顶部
uuooii[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107968
精华 0
积分 363
帖子 345
信誉分 100
可用分 2631
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
9

发表于 2014-2-3 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前几天结果出来了，总结了一下，方法是可以的，就是可以两种不同的抗体可以加在一起，条件是二抗必须相同。
但是，由于的两个蛋白是32KD和36KD，分子量及其相近，我用的12%的胶，原以为跑的很开，结果，并没有像想象中的一样跑的很开，两条带子发出来靠的很近，乍一眼看上去像是杂带了。所以还是不建议用于分子量靠的很近的蛋白。但不知15%的胶可不可以跑开，后来怕浪费抗体，就没有继续试！
顶部
uuooii[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107968
精华 0
积分 363
帖子 345
信誉分 100
可用分 2631
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
10

发表于 2014-2-3 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ffooll 于 2014-2-3 18:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

32KD和36KD完全能分开吧，我的42KD和38KD跑10%的胶都能分开。你的分离胶是不是太短了啊！

不是，因为我下面还要跑一个17KD的蛋白，所以就没让溴酚兰跑的太底
顶部
 12  1/2 12››