【求助】蛋白的质谱分析

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标题:【求助】蛋白的质谱分析

dior[使用道具]
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发表于 2014-2-3 18:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好
我有一个蛋白，纯化之后出现两个条带，经western blot杂交，都可以杂上，而且可以肯定不是提前终止造成的，因为我两端都加标签纯化的
看到一篇文献，他们做的蛋白有类似现象。他们拿去做maldi-tof，根据两个条带的m/z差，软件推测其中大的一个可能是被糖基化的。最后他们进一步用液相色谱质谱联用，得到具体糖基化位置和糖基的结构。
我查了很多文献，都是说把某个蛋白先用胰蛋白酶切，再上质谱，得到指纹图谱。但我上一段里边讲到的文献貌似是将整个蛋白拿去做的质谱（大概16-17kd）。我是想问，到底可不可以将整个蛋白不经酶解拿去做质谱（maldi tof）呢？对大小是不是有限制呢？我的大概30kd左右。
大家可能会问我干嘛非要全长拿去做呢。我是想像刚才提到的文献那样，先看看二者m/z差别，看是否确实有糖基化存在。而蛋白的身份，我觉得western blot还是足够验证了。
不知道我的想法是否正确，请各位指教指教。。

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-2-3 18:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以直接在TOF上做，只要你的样品够纯、量够大（100pmol以上）。另外，在这个范围测的质荷比不会很准，如果真有糖基化的话，由于糖链的不均一性，很可能得不到好的质谱图。

dior[使用道具]
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发表于 2014-2-3 18:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yueban-1147 于 2014-2-3 18:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可以直接在TOF上做，只要你的样品够纯、量够大（100pmol以上）。另外，在这个范围测的质荷比不会很准，如果真有糖基化的话，由于糖链的不均一性，很可能得不到好的质谱图。 ...

你的意思是可以对intact蛋白进行tof分析，但是对样品有要求，而且效果不会很好？样品量，100pmol我算了下，估计4-5ug的样子，一般sds-page跑出来应该可以满足吧？

dior[使用道具]
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发表于 2014-2-3 18:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是我说的那片文章做出来的质谱图

附件

2014-2-3 18:58

71104772.jpg (54.94 KB)

101010[使用道具]
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发表于 2014-2-3 18:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

若是看蛋白质的整体的m/z是可以不做酶解的，直接上质谱就可以，若是想知道这个蛋白是什么就得酶解了

youyou99[使用道具]
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发表于 2014-2-3 18:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该说你的这种情况如果直接做PMF(肽指纹图)的话是无法看出两个蛋白之间差异的,因为两个蛋白在做酶切后会到数据库中搜索,得出匹配的条带,如果你是想鉴定该蛋白的话可以用这种方式,但是如果真像楼主描述的有可能是糖基化的话做PMF是没有意义的
如果说SDS-PAGE后考染可以看到条带的话,应该说上质谱问题应该不大,不过最好还是测定下你所纯化出的蛋白的浓度,最好能够上pmol/ul,30KD大小对TOF来说是没有问题的,可以放心,如果直接打质谱在30KD左右出现m/z相差100-200的两簇峰就很有可能是糖基化了,你先试试看吧.

dior[使用道具]
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发表于 2014-2-3 19:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 youyou99 于 2014-2-3 18:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

应该说你的这种情况如果直接做PMF(肽指纹图)的话是无法看出两个蛋白之间差异的,因为两个蛋白在做酶切后会到数据库中搜索,得出匹配的条带,如果你是想鉴定该蛋白的话可以用这种方式,但是如果真像楼主描述的有可能是糖 ...

再弱弱的问问。。。
如果用胰蛋白酶消化的话，应该会得到很多的片段，那么是否每个片段都可以在质谱图上看到呢？如果可以看到的话，那么有糖基化现象的那个片段会在两张图谱上显示出差异对吧？
但是从文献上看，做PMF往往只是有部分的肽段可以和数据库匹配，是否就是说并非所有的酶切片段都可以在图谱上面看到啊？

二丫头466[使用道具]
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发表于 2014-2-3 19:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的最终目的好像是，确认一下确实有糖基化存在？
如果是这样的话，为什么不用简单一些的方法？如下：
1，免疫沉淀下目的蛋白
2，去糖基化酶（具体名称忘记了）处理目的蛋白
3，wb检测是否还有糖基化条带

dior[使用道具]
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发表于 2014-2-3 19:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的情况是从原核表达的蛋白，所以不用2d电泳那么麻烦。。。
不过兄台的意见还是值得考虑。谢谢啦，我查查看

youyou99[使用道具]
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发表于 2014-2-3 19:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 dior 于 2014-2-3 19:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

再弱弱的问问。。。
如果用胰蛋白酶消化的话，应该会得到很多的片段，那么是否每个片段都可以在质谱图上看到呢？如果可以看到的话，那么有糖基化现象的那个片段会在两张图谱上显示出差异对吧？
但是从文献上看，做PMF往往只是 ...

理论上说，酶切后得到的所有肽段都会出峰，但是在搜库时往往仅有部分肽段能够与数据库中肽段匹配上，然后会得到的一个分值，根据分值的大小来判断结果是否可信．
糖基化的蛋白酶切我没做过，但是我认为如果糖基化位点位于胰酶的酶切位点附近的话是有可能会影响酶切的，也就是说有可能少得到一些峰，但是要判别两张图中的差别还是比较困难的．
直接测定分子量不仅省了酶切的费用也很节省时间啊．
呵呵，祝楼主好运了！

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