蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】beta-actin作为内参？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 11  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】beta-actin作为内参？

ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态 离线
1

发表于 2014-2-3 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】beta-actin作为内参？


beta-actin是细胞骨架蛋白，主要存在胞质，问题是胞核内也存在吗？是否可作为核内NF-kB的内参呢？？
顶部
xiaoxiaoniao[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 108878
精华 0
积分 509
帖子 677
信誉分 100
可用分 4049
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
2

发表于 2014-2-3 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

beta-actin是细胞骨架蛋白，主要存在胞质，文献没表明存在胞核，核内NF-kB的内参以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了），但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。三种同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。
顶部
ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态 离线
3

发表于 2014-2-3 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但是有些paper 还是用的betaactin做wb的内参，比如
Provinol Prevents CsA-induced Nephrotoxicity by Reducing Reactive Oxygen Species, iNOS, and NF-kB Expression
Barbara Buffoli, Olga Pechánová, Stanislava Kojsová, Ramaroson Andriantsitohaina, Lorena Giugno, Rossella Bianchi, and Rita Rezzani
J. Histochem. Cytochem., Dec 2005; 53: 1459 - 1468.
Pregnancy-Specific Down-Regulation of NF-B Expression in T Cells in Humans Is Essential for the Maintenance of the Cytokine Profile Required for Pregnancy Success
Sharon A. McCracken, Eileen Gallery, and Jonathan M. Morris
J. Immunol., Apr 2004; 172: 4583 - 4591.
麻烦再解释一下
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
4

发表于 2014-2-3 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不可以的，这样做loading control就没有意义了。
我不知道你是否抽提了cytoplasmic and nuclear proteins,还是whole cell lysate？
对于Beta Actin， 用于Whole Cell / cytoplasmic
分子量: 43
caution: Not suitable for skeletal muscle samples. Changes in cell-growth conditions and interactions with extracellular matrix components may alter actin protein synthesis (Farmer et al, 1983).
如果你loading的是nuclear proteins, 你可以用下面的作为内参：
Lamin B1
Nuclear
66kd
Not suitable for samples where the nuclear envelope is removed.
TATA binding protein TBP
Nuclear
38kd
Not suitable for samples where DNA is removed.
所以关键是看你用什么样的蛋白！
祝好运！
顶部
ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态 离线
5

发表于 2014-2-3 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我就是抽提了cytoplasmic and nuclear proteins，但是看到上面的文章，有点困惑，所以请教下，那GADPH可以吗？？
顶部
ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态 离线
6

发表于 2014-2-3 21:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
而且有些文章在做wb的时候，好像没有内参图？我不知道他们是怎末确定上样量的准确的，单纯依靠测出来的上样蛋白浓度？？
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
7

发表于 2014-2-3 21:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GAPDH也不能用于你的实验，因为它一般主要用在the whole cell lysate和cytoplasmic proteins.
我个人意见是因为你只想要检测NF-Kappa B在核内的表达，就直接用nuclear proteins作为你的样本来做WB，可以用lamin B作为loading control，当然如果你也想看看cytoplasmic proteins话
，你就作为另外一组，用另外一个内参。
有些实验是不用内参，例如抽提enriched peroxisomal fractions,当你把它和上清蛋白一起上样做WB时，就没有合适的内参可以用，直接根据蛋白的浓度来上样相同的蛋白量。此外，实验往往是重复几次的，所以结果也是完全可以相信的。
顶部
ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态 离线
8

发表于 2014-2-3 21:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最后在问个弱问题：没有内参，怎末定量呢？？
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
9

发表于 2014-2-3 21:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想你所说的定量只是那种相对的定量吧，其实很多WB结果看条带的大小或者密度的深浅就可以说明问题了，如果你一定要弄个数据，然后做个柱状图，你可以用你的对照组作为100%，看看其他实验组的条带降低或者提高了几倍或者百分之几！有相应的软件可以分析的。
顶部
ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态 离线
10

发表于 2014-2-3 21:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个软件系统叫什么，我打听下？？谢谢
顶部
 11  1/2 12››