蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】融合蛋白为什么从上清转到沉淀中了？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 11  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】融合蛋白为什么从上清转到沉淀中了？

红袖添香[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107969
精华 0
积分 153
帖子 66
信誉分 100
可用分 1036
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
1

发表于 2014-2-3 22:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】融合蛋白为什么从上清转到沉淀中了？

做了个GST融合蛋白，去年诱导表达时上清中表达量很高，今年重新活化后诱导表达，发现沉淀中量相当高，而上清中的量很少，降低温度和诱导物后过夜诱导，效果也不理想，不知道是何原因?
哪位高手帮忙解决下，谢谢！
顶部
standup[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107982
精华 1
积分 231
帖子 137
信誉分 102
可用分 1481
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
2

发表于 2014-2-3 22:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
菌种退化，建议重转质粒，再进一步筛选！
顶部
yapuyapu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76072
精华 3
积分 574
帖子 695
信誉分 106
可用分 4338
专家分 30
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
3

发表于 2014-2-3 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做了个GST融合蛋白，去年诱导表达时上清中表达量很高，今年重新活化后诱导表达，发现沉淀中量相当高，而上清中的量很少，降低温度和诱导物后过夜诱导，效果也不理想，不知道是何原因?
哪位高手帮忙解决下，谢谢！

==============================================================================================================

首先表达菌种是不能进行长期保存的，其特性很可能就丢失或改变了，从而形成了很多包含体。所以重新转化质粒到克隆菌种和表达菌种即可。
顶部
红袖添香[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107969
精华 0
积分 153
帖子 66
信誉分 100
可用分 1036
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
4

发表于 2014-2-3 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢！不过我做的时候菌种是重新由质粒转化并筛选的，感受态也不超过2月，转化效率还很高。不知道咋回事？
顶部
yueban-1147[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75776
精华 0
积分 692
帖子 1064
信誉分 100
可用分 6113
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
5

发表于 2014-2-3 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说句实话，GST融合对促进蛋白折叠、可容效果不明显。
很可能就是在包涵体中。
如果不放心可以 尝试pmal质粒。
如果以前的确作出可溶表达的情况那么建议低温：18度。
顶部
xue258[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75643
精华 0
积分 746
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
6

发表于 2014-2-3 22:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知现在是否是增加的培养量，加大培养量后，在转速、通氧量上都会有变化，否则表达效果不好。
再者，诱导物诱导时间过长也不好，蛋白过量表达也会沉淀。
顶部
红袖添香[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107969
精华 0
积分 153
帖子 66
信誉分 100
可用分 1036
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
7

发表于 2014-2-3 22:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这几天尝试了下不同温度和不同的菌落诱导，感觉在28度过夜诱导有时有些带，大部分还是在沉淀中，16度诱导过夜效果也不好。我想一方面加大培养量看能不能纯化些蛋白，另一方面尝试从包涵体中纯化试试，不知道各位有么建议。
顶部
了了[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73224
精华 0
积分 367
帖子 453
信誉分 100
可用分 3031
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
8

发表于 2014-2-3 22:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白也不能表达到上清中，只能从包涵体中拿蛋白了
顶部
applebook=213[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74101
精华 6
积分 525
帖子 405
信誉分 112
可用分 2981
专家分 60
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
9

发表于 2014-2-3 22:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

表达菌一旦构建成功，就应该不停进行表达以及不停的短期冻存和复苏，否则性质很容易产生改变，那么就需要重新进行构建，麻烦！
顶部
红袖添香[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107969
精华 0
积分 153
帖子 66
信誉分 100
可用分 1036
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
10

发表于 2014-2-3 22:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的性质发生改变，是对菌株而言吧，将构建好的载体质粒重新转化不行吗？
顶部
 11  1/2 12››