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标题:【讨 论】2D电泳结果疑难解析

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【讨 论】2D电泳结果疑难解析


生命科学领域发生的革命性变化,对生命活动的研究正在从传统的还原式研究转向了整体性的研究——以基因组学(功能基因组学)和蛋白质组学为基础的系统生物学。其中蛋白质组学包括表达蛋白质组学(expression proteomics)、结构蛋白质组学(structural proteomics)和功能基因组学(functional proteomics)。而双向电泳则是蛋白质组学,尤其是表达蛋白质组学的经典方法。
由于双向电泳对于许多研究人员来说是个陌生的技术,所以一旦在电泳染色后出现费解的电泳图是件令人头痛的事:不知道问题出现在哪,也不知道如何去改正。这里来自GE公司的专家列出了几种常见出错电泳图,虽然不是非常全面,但是如果您也在实验中遇到了这样的问题,希望能从这里得到参考。
首先,来看看漂亮的2D电泳图


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问题1. 氨基甲酰化(Carbamylation trains)导致太多蛋白斑点串,不属于常规的磷酸化等修饰
可能原因:尿素(urea)不纯
建议:用更纯的尿素,避免样品加热,或者用Amberlite IRN-150L去异氰酸盐(isocyanate)阿


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问题2. 蛋白样品制备步骤错误导致蛋白丢失
可能原因:样品制备TCA/丙酮沉淀后用预冷的丙酮洗涤沉淀,导致TCA残留
建议:用90%丙酮/10%H2O洗涤,可以彻底洗去TCA


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问题3.不同的样品制备步骤导致完全不同的蛋白斑点图谱
对于样品制备而言,没有一个固定的方法,更多的时候要根据样品的特性,以及一些文献的参考进行优化,下面是一个植物样品的例子:
若采用常规的标准裂解液,样品溶解不充分  用甲醇沉淀后复溶,效果也不明显  TCA/丙酮沉淀较适合这一样品


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4.正常情况
正常情况,右边的垂直条带包含了所有pIs值>pH7的蛋白。


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问题5. 样品含高丰度蛋白导致出现水平条带
可能原因:高丰度蛋白聚集后,若采用胶面朝下的胶条槽,易造成水平条带。
建议:采用杯上样胶条槽或manifold等胶面朝上的胶条槽。


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问题6. 出现水平条带(窄pH范围胶条)
可能原因:聚焦不够,或者盐离子过多
造成水平条带的其它原因:
Detergent去污剂浓度过低
尿素浓度过低
DTT浓度过低,或者用量过少
上样位置不合适(比如cup loading)
蛋白酶活性
胶条溶胀时间过短
样品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr / 40,000 g)
空气中的CO2


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问题7. 试剂不新鲜
可能原因:TEMED不新鲜。
建议:尽管TEMED用量很少,还是建议每年更换一瓶TEMED


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问题8.试剂质量影响蛋白斑点成像
可能原因:Tris质量不好


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问题9. 步骤错误导致蛋白丢失
可能原因:蛋白转移电压过高(400V,18cm胶)——在开始的45分钟内不要超过2W/gel(Ettan size)


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