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标题:【求助】蛋白溶解

idoww[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白溶解


请问各位网友,我提的细胞膜蛋白,已经冻干了,打算做WESTERN,用什么来溶解才能保证蛋白不降解呀?
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vcve[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很简单，用1×PBS(pH8.0左右)一般就可以。
或者用50mM Tris-HCl (pH8.0)水溶液。
如果害怕蛋白沉淀还可以在上述溶液里面加入1～5％的甘油，1％的甘氨酸然后再溶解冻干的蛋白粉末。
以上可以满足绝大多数的情况。
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发表于 2014-2-5 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
溶解液中要加蛋白酶抑制剂来防止蛋白降解吗？
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uaubc[使用道具]
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 小中大

本来的冻干就可以稳定保存，你冻干的过程中，盐（离子）仍然在样品中，所以你在溶解的过程中，加入原始体积的去离子水就可以拉，如果想稀释再用缓冲液稀释就可以了，当然为了防止降解，还是可以加一点蛋白酶抑制剂的
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发表于 2014-2-5 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"本来的冻干就可以稳定保存，你冻干的过程中，盐（离子）仍然在样品中，所以你在溶解的过程中，加入原始体积的去离子水就可以拉，如果想稀释再用缓冲液稀释就可以了，当然为了防止降解，还是可以加一点蛋白酶抑制剂的 "
另外:冻干之前有可能是在水中透析的,所以一定要知道冻干之前的状态;如果在缓冲液中冻存,一般冻干还有浓缩的作用,不会加入原始体积的去离子水,因此盐离子的浓度是比较高的,如果需要还需要1*缓冲液透析
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发表于 2014-2-5 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很简单，用1×PBS(pH8.0左右)一般就可以。
或者用50mM Tris-HCl (pH8.0)水溶液。
如果害怕蛋白沉淀还可以在上述溶液里面加入1～5％的甘油，1％的甘氨酸然后再溶解冻干的蛋白粉末。
以上可以满足绝大多数的情况。

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我的蛋白样品总是溶解不好，老有沉淀，加入甘油甘氨酸就可以了？那量怎么控制，每毫克加多少可以使沉淀溶解的好还不会降低蛋白浓度？谢谢了
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加入甘油和甘氨酸可以是蛋白沉淀溶解的好，那量怎么控制呢，既可以是蛋白溶解的彻底还不会是蛋白稀释得太多？谢谢了
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发表于 2014-2-5 22:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不用这么麻烦吧,既然是做western blot,那么直接用1*loading buffer溶解就可以了,loading buffer中的SDS可以使蛋白酶变性而丧失活性,所以基本不用担心会被降解.
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hyuu[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我曾经也遇到过这种问题，用去离子水溶解不了，之后就尝试 调PH就溶解了。奇怪哦
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iii_ii[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室有用4%的SDS溶解的，我们是用普利来的蛋白提取试剂盒提出的蛋白膜，放在-20度保存，用的时候拿出来加4%的SDS后，反复冻融，但是要反复多次，可能需要几天的时间。我溶过一次，不知道是不是反复冻融的次数少了，溶完后测的蛋白浓度很有问题，而且煮后蛋白成胶冻状，完全失败了。不知道怎么回事，以前实验室的师姐也是这么做的，人家就溶的很好，我还不知道是什么原因，猜测是冻融次数不够，没有充分溶解，想请教一下大家有没有更好的方法溶解蛋白沉淀？
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