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标题:【求助】50ug上样量WB条带隐约可见？浓缩蛋白？

nikun230[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】50ug上样量WB条带隐约可见？浓缩蛋白？


我是提取组织核蛋白做WB的，但是浓度太低，只有1ug-3ug/ul,加大上样蛋白量至50ug跑出来的在阳光灿烂的时候条带隐约可见的，根本不能扫描，我的目的蛋白是NF-KB，我也知道可能目的含量蛋白浓度低，但是，我好歹上了50ug的上样量啊
我提取的蛋白现在每个样本只剩下300--50ul了，现在不敢做了，请问各位大虾我这个情况下步怎么做？如何浓缩蛋白？
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dhpbj[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果50ug都杂不出来，如果抗体又没有问题，我觉得你可能是杂的磷酸化的nfkb吧，不过磷酸化的nfkb是进核的吧，你看看你的细胞裂解液，能不能裂核，或者直接提核蛋白。
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nikun230[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dhpbj 于 2014-2-5 22:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果50ug都杂不出来，如果抗体又没有问题，我觉得你可能是杂的磷酸化的nfkb吧，不过磷酸化的nfkb是进核的吧，你看看你的细胞裂解液，能不能裂核，或者直接提核蛋白。 ...

我用的核蛋白抽提试剂盒提的核蛋白和胞浆蛋白，nfkb为65KD，我电泳用80V（浓缩胶），120（分离胶）共jingle2h,转膜用的320MA（两个胶） 2h ,但是我的转膜系统按电流不好调，我就用的100V 2h,预染的marker很清楚，但是显色后膜上基本是空的。方法有什么不妥？
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lorri[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白没提好，重新提吧。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

核蛋白应该多上样品
建议100ug
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nikun230[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 sunnyB 于 2014-2-5 22:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

核蛋白应该多上样品
建议100ug

大哥啊。我上样50ug，因为我的蛋白浓度是0.9--2.0ug/ul的，所以上样50ug就要50ul以上的体积啦，我用3.5*11的梳子也不可能达到100ug的上样量啊！（因为制胶不可能能上那么多），我剩下的蛋白每个标本也就250ul啦，请问这么少的蛋白能采用什么合适的蛋白浓缩方法？
感谢万分！
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nikun230[使用道具]
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发表于 2014-2-5 22:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dhpbj 于 2014-2-5 22:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果50ug都杂不出来，如果抗体又没有问题，我觉得你可能是杂的磷酸化的nfkb吧，不过磷酸化的nfkb是进核的吧，你看看你的细胞裂解液，能不能裂核，或者直接提核蛋白。 ...

是的，是磷酸化后入核的NF-KB。
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阿k[使用道具]
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 小中大

你测的是细胞浆的nfkb还是胞核的啊，细胞浆的p65有表达吗？
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