【求助】层析过柱前样品处理，0.45um滤过不去

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标题:【求助】层析过柱前样品处理，0.45um滤过不去

changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

亲和层析前处理样品，0.45um滤膜过不去，没多少滤器就堵住了。
之前已经12000rmp，30min离心过了取的上清。
试过加 Binding buffer 稀释，但是1：10以后还是不怎么好滤。
请教各位该怎么办？
个人想了2个办法：
1. 改成超速离心，准备上40000-50000rpm 离它1h试试看。
2. 加入PEG/ NaCl。这种方法我沉淀过噬菌体，直径0.8um左右的。不知道沉淀细菌碎片效果如何？
有没有站友遇到过类似的情况？谢谢！

dmg[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先要说明白是什么样品
是血清呢？还是细胞表达上清，还是菌体或者细胞裂解液
不然别人怎么帮你分析

ha111[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，遇到过类似的情况。
我们需要过滤0.22um的，也是过滤不过去，用了两个方法。
1.先用0.45um的过一遍，我想你的情况可以考虑用普通的滤纸先过一遍看看吧。
2.换了一份过滤膜，milliQ有一份筒式的过滤器，比普通的过滤膜过滤量要大。差不多能过滤50ml左右吧。我用的是手动过滤的，有一个技巧，就是刚开始的时候别太用力，否则很容易堵住。慢慢压，应该没问题。
3.我想还可以换树脂，用cellthru类型的，就不用过滤了。
供参考。

changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先要说明白是什么样品
是血清呢？还是细胞表达上清，还是菌体或者细胞裂解液
不然别人怎么帮你分析

============================================================

不知道沉淀细菌碎片效果如何？

============================================================

不知道血清呢？还是细胞表达上清，还是菌体或者细胞裂解液有什么不同？
滤不过的处理方法有不同吗？
血清用A方法？
细胞表达上清用B方法？
菌体裂解液用C方法？
细胞裂解液用D方法？

ha111[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

血清一般蛋白含量高，如果实在滤不过，可以先做一个硫酸铵沉淀，粗分一下蛋白组分，有很大一部分白蛋白和球蛋白可以除去，但根据我个人的经验，血清的组分其实是很稳定的，一般12000转离心后短时间不要反复冻溶是不会有新的沉淀产生的。
细胞表达上清，一般蛋白含量不是很高，离心后过滤，保持缓冲体系和温度不变，短时间内出现新沉淀的可能不是很大
菌体和细胞裂解液有些蛋白组分不稳定，有时即使你离心了，但是先前可溶的一些蛋白质会因为自身的不稳定性以及一些蛋白和蛋白酶的互相作用，导致蛋白变性，沉出来。
一般12000RPM离心后的液体，过0.45um的膜应该完全没有问题
我猜测楼主这种情况很有可能就是蛋白质离心后，虽然驱除了不溶的部分，但是过了一会马上就有新的不稳定蛋白沉出来了，或者某些可溶的蛋白在过膜的过程中容易和膜吸附，导致在膜上堆积沉淀。
建议楼主改变一下缓冲液的组分，增加稳定性，防止蛋白质再有沉淀或者积聚发生

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发表于 2014-2-5 23:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主的问题解决了吗？我也遇到了与楼主同样的问题，请楼主不吝赐教，谢谢，非常急！

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发表于 2014-2-5 23:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先试一下加大离心转速看看怎样，还不行就先用更大孔径的滤膜来滤

skytree[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

调PH值试一下？

u234[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一次离心后取上清，把上清再告诉离心15min以上。
还可以试试装1cm高的凝胶填料，把上清过一遍，相当于过滤。
然后再滤膜过滤。
如果是上面说的不稳定蛋白不断沉淀析出，那就需要注意离心和过滤等所有操作都在同一温度，要么都在冷库，要么都在室温。还有要考虑buffer条件。

c86v[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

确实跟材料有关系。
一般的细菌破碎液，12000rpm 30min后，上清应该就可以过0.45um滤膜了。
而昆虫细胞的破碎液则几乎无法过滤，我曾经用14000rpm，30min，取上清后重复离心3次，都不能滤过。
此外，还跟过滤器具有关。
millipore的那种一次性就比国产那种塑料的加滤膜的容易过滤多了，如果用不锈钢滤器，空压过滤大量溶液也比注射器手动过滤容易。
实在不行只能多次过滤直接上样了，如果是预装柱，他有膜可以阻挡部分颗粒杂质；如果是自装柱，不行就拆装。

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