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标题:【求助】毫克级的蛋白酶解

蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】毫克级的蛋白酶解


提取的样品很宝贵，冻干后只有几十毫克，需要酶解，老板说几十毫克足够酶解了，但是在酶解条件未知的情况下怎么利用这几十毫克样品finish酶解实验呀。。。。
请各位大虾帮忙，告诉我哪里有相关的文献？或者告诉我你的经验。谢谢。。。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的试验目的是为了证明什么，准备用什么方法来检测结果？
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蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的目的是要酶解后的多肽 要找到彻底酶解该蛋白的酶解条件， 要分离纯化得到的各种多肽 并分析它的生物活性。
检测的方法试过TCA方法，不知道是酶解效果不好还是测试方法不够灵敏 结果并不理想。
期待回答。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

产物跑个蛋白电泳可以吗？一丁点蛋白就足够染色了，看看原蛋白的条带的亮度，弥散程度
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蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2014-2-5 23:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的目的是想找到合适的检测方法 将样品彻底酶解。
更大的问题是我看到的文献关于酶解 其所用的样品蛋白含量均为数克级别的
而我的样品量极少，只有几十毫克，所加的酶量更少 这样酶解后的检测误差很大（尚未找到合适的检测方法）。
所以，求助大家 有没有 关于毫克级蛋白酶解这方面比较好的文献或者方法？
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发表于 2014-2-5 23:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

5-10ug 蛋白足够
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发表于 2014-2-5 23:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以配个1mg/mL的蛋白母液（这个浓度已经足够高了），然后按蛋白梯度或者酶梯度或者时间梯度做酶切实验，每个反应用10ug蛋白就足够电泳检测了，体系20uL就够了，切完跑SDS-PAGE看切得情况，这样1mL样品够做很多次了。
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发表于 2014-2-5 23:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你们的意思是说蛋白10微克足够反应吗？
也是采用稀释的方法做的吗？
一个问题是检测的方法的灵敏度能否达到这个水平？
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yapuyapu[使用道具]
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 小中大

为什么你会觉得不够反应呢？
检测的话，如果你所说的检测的方法是指电泳，而且品成分比较单一的话，那就足够了
考染的灵敏度大约50ng，银染的灵敏度几个ng肯定没问题
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蒜泥面条[使用道具]
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发表于 2014-2-6 00:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我之所以觉得不够反应是因为我以为没有合适的检测方法做出那条反应趋势图线。（以为检测方法灵敏度不够）
成分应该挺多，我原来采用的是TCA的方法，但结果没有趋势。
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