小中大我准备做一个基因的原核表达，现在已经亚克隆到T载体上测序。测序结果出来后发现有三个aa发生突变，而且是极性与非极性之间的突变，我的目的基因全长是2151bp，这样是不是不能直接用于连表达载体做表达啊？有没有什么解决办法？先谢谢各位了！我也是第一次做表达啊。
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这位战友，你遇到的问题我也曾经遇到过。当时我扩增一个2.5Kb的基因，GC含量72%，其中局部GC含量大于80%。测序也发现了很多突变点，最严重的克隆大概100-200bp就有一个突变。我当时真是欲哭无泪啊。
根据曾经的经验，我觉得有以下几个方法你可以试试：
1. 首先TaKaRa的LA Taq扩增能力确实没得说，但是保真性没有他们标识的那么好。所以你可以从Taq酶和反应条件入手解决问题。
a.在你的LA Taq反应体系中加入等量或半量的pfu高保真酶。
b.换用TaKaRa的primerSTAR HS DNA Taq。这个酶要比LA Taq保真性要好。我用它扩过4kbp的片段。我们这边别的实验室有扩过6kbp多的。都没有问题。TaKaRA公司标称这个酶的突变概率是25kb突变12bp。
c.PCR过程中不要用太多的循环次数，一般以30个循环为宜。如果觉得30循环产物量太低可以考虑稍微增加模板量。
2. 把你已测序的几个克隆拿出来进行比对，看看没有突变的片段能不能拼成一个完整的片段。 然后再从中寻找合适的酶切位点，把正确的片段分别酶切下来再进行连接。
当然有没有合适的酶切位点有太多的运气成分。第一，酶切位点要能把正确的片段切下来。第二，这个酶切位点在你的目的基因中最好只有一个。第三，你的质粒上没有这个酶切位点。要同时满足这三个条件还是不太容易的。到目前为止我只用这个方法修复过一个载体。
3. 把你的目的基因中的突变点修复过来。
大概的原理和定点突变的道理是完全一样的。
a.一次修复一个点。设计一段新的引物，引物覆盖你载体中的一个突变位点，当然引物中的这个点一定是正确的。然后用这对新的引物PCR扩增你的载体。这样就可以修复一个点。
不过a方法只是一种可能性，具体实施过程中比较麻烦，而且成本很高，但是可以给你一个修复的思路。具体原理和图示你可以看看TaKaRa目录册的C-31页。
这里声明一下本人不是TaKaRa的销售人员，也不是TaKaRa的拖。只是在我个人学习过程中，这本目录册中给了我很多启发，里面的很多东西是教科书上所找不到的。而且我们从目录册中学习的不过是其中的原理和方法，其实很多东西都可以不用买他们的盒子，只要懂了原理，我们完全可以用手头的试剂自己做。
b. 一次修复多个点。这个方法很快，但是比较贵。具体也可以看看TaKaRa目录册C-33页。
c. 用Overlap一次修复多个点。这个方法稍微麻烦一点。但是成本很低。
具体的原理是：设计新的引物用pfu酶把你已测序的克隆中的正确片段PCR出来，引物刚好覆盖你的突变区域，并且引物中的这个点是完全正确的。这样就可以把你的目的基因分成几个片段扩增出来。然后把这些片段进行胶回收。因为相邻片段的引物末尾有重叠，所以你可以把相邻的两个片段的回收产物彼此当作引物和模板加入反应体系进行PCR。这样以此类推就可以把全长连接起来了。更详细的原理和方法你可以在丁香园里找找。我也是受丁香园里帖子的启发，才修复好我的载体的。
以上是我自己的构建载体时的一些心得体会，说的比较笼统，具体操作起来没有我上面说的那么简练。有些小的细节可能得你自己亲自做了，才能有体会。
如果你确定用某一个方法做了，咱们可以就一个方法再进行交流。
欢迎你继续发帖交流。我现在完全能体会你的心情。我当时遇到这个问题的时候，没有人指导我下一步该怎么办，加上老板对分生的东西懂的很少，不停的给我压力，我差点就放弃了。现在回头再来看看这段经历，觉得还是十分值得的。希望你继续努力
