蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】融合蛋白酶切、鉴定问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 18  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】融合蛋白酶切、鉴定问题

memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
1

发表于 2014-2-7 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】融合蛋白酶切、鉴定问题

我表达了一个麦芽糖融合蛋白，麦芽糖大约42KD，我的目的蛋白10KD左右，送质谱测序都测不到我的目的蛋白（我觉得可能是目的蛋白太小的原因吧），明年初就要答辩了，时间比较急，不知道我要如何鉴定我的目的蛋白呢？有什么比较快的方法？请大家帮帮忙
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
2

发表于 2014-2-7 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不是大小的事，应该是浓度不够，你问问测序的老师，我记得浓度要达到一定程度才可以，你可以先浓缩一下再送样！
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
3

发表于 2014-2-7 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不是大小的事，应该是浓度不够，你问问测序的老师，我记得浓度要达到一定程度才可以，你可以先浓缩一下再送样！
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
4

发表于 2014-2-7 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到同样的问题，也是麦芽糖融合蛋白做载体，但测序的时候M13那一段测不出来，我的目的基因是1kb，在上海生工测的，只测出了mbp那一段的序列，还在找原因中，虽然帮不上什么忙，但可以交流一下！
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
5

发表于 2014-2-7 20:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

浓度不够可以测出麦芽糖吗？请教下楼上，谢谢！
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
6

发表于 2014-2-7 20:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到同样的问题，也是麦芽糖融合蛋白做载体，但测序的时候M13那一段测不出来，我的目的基因是1kb，在上海生工测的，只测出了mbp那一段的序列，还在找原因中，虽然帮不上什么忙，但可以交流一下！
你的蛋白应该比我的大啊，为什么也只测到MBP呢？现在原因出来了吗？还有什么方法可以鉴定吗？希望交流。
顶部
leifengta[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77488
精华 0
积分 514
帖子 748
信誉分 100
可用分 4517
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
7

发表于 2014-2-7 20:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、进行DNA测序,保证构建正确；
2、融合蛋白作WB鉴定；
3、用蛋白酶切掉麦芽糖融合蛋白，再质谱测序。
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
8

发表于 2014-2-7 20:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

WB做不了，目前没有这个抗体卖，我用麦芽糖蛋白酶切，没有成功，不知道楼上的做过没？指教下。还有一个问题就是，如果切出来之后，10KD的蛋白考马斯亮兰染色能染出来吗？听说好像不行哦
顶部
leifengta[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77488
精华 0
积分 514
帖子 748
信誉分 100
可用分 4517
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
9

发表于 2014-2-7 20:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我正好用pMAL原核表达系统做过麦芽糖结合蛋白与目的蛋白的融合表达与纯化。
1、有针对麦芽糖结合蛋白(MBP)的抗体做WB, anti-MBP mAb 或anti-MBP antiserum，见NEB的目录；
2、有Factor Xa 或Enterokinase等蛋白酶可以切割，如果酶切不成功，也可以从一个方面说明你表达的蛋白有问题；不过蛋白酶切条件要摸索，要做一个酶切梯度
3、另外10KD的蛋白考马斯亮兰染色是能染出来的
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
10

发表于 2014-2-7 20:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.用麦芽糖结合蛋白的抗体做WB有什么意义？
2.我现在正在酶切，还没有成功，你所说的酶切梯度怎么设计？可以具体点吗？
3.你确定10KD能染出来吗？以前有师兄做10KD的，测序对了，但跑胶染不出哦
谢谢
顶部
 18  1/2 12››