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标题:【求助】双向电泳鉴定差异点之后还要不要做western啊？

ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】双向电泳鉴定差异点之后还要不要做western啊？


请问双向电泳鉴定差异点之后还要不要做western啊？
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好做下，可以验证下或者做免疫组化也可以
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发表于 2014-2-7 21:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想不是应该做下，而是必须做。
双向电泳是个重复性不高的实验，而且是个烧钱的实验，早前的研究只要鉴定处蛋白差异点，然后稍微做个什么WB或者组化就可以发个比较好的paper，但是时间长了，做的人多了，门槛也就高了，很差的杂志要求都会相对高很多。做WB或者组化或者ELISA验证蛋白（根据蛋白的特性）可以说是必不可少的东西。事实上，即使这样发高级的文章还是有难度，最好是能够对该蛋白进行功能上的验证。
找个细胞系，做个RNAi或者是进行质粒（病毒）之类的稳定转染，过表达该蛋白，看看过表达和抑制表达对细胞的功能影响（比如肿瘤细胞的侵袭性，成瘤作用或者是细胞周期、凋亡之类）。此外，还可以根据该蛋白涉及到的信号通路在该蛋白表达变化后有何影响。当然，这是更加深入的研究。
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发表于 2014-2-7 21:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上说的非常有理！我目前也处于这个阶段，
对于活的质谱测序结果，不知道如何进行wesgtern ，能否告诉个技术路线！
怎么来获得抗体比较好？
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发表于 2014-2-7 21:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上说的非常有理！我目前也处于这个阶段，
对于活的质谱测序结果，不知道如何进行wesgtern ，能否告诉个技术路线！
怎么来获得抗体比较好？

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个人感觉
如果你研究的物种有完整的数据库的话，质谱一般可以鉴定出目的蛋白，可以购买商品话的抗体，直接做WB，没有商品话的抗体，可以考虑原核或着真核表达制备抗体，如果该目的蛋白真的很有意义的话。
没有数据库的话可以考虑做串联质谱，等待部分序列，在rna水平做验证。
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发表于 2014-2-7 21:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
怎么我看很多最近发表的文章并没有都做western，而是用Ingenuity Pathway Analysis分析差异点，不过多数是发表在非proteomics上的其他杂志上的，
不知高手们对此怎么看？谢谢！
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发表于 2014-2-7 21:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉proteomics越来越重视对技术上的要求了
我觉得最开始蛋白质组的研究思路很简单，就是跑胶，一个对照一个处理，差异点做质谱，也就是所谓的差异蛋白质组学，也有些条件好有钱的地方对细胞的某一时期或某一生理状态下的所有2D跑出来的蛋白质进行质谱鉴定，做些简单的生物信息分析，对点进行分类，做一个所谓的组学上的研究，并且现在也有不少实验室还在采取这种思路。只不过单纯这样的研究越来越难发点数高的文章了，除非发现了些特别的东西，或者引入了一些新的思路或者技术手段。
随着蛋白质组的发展，2D也受到了不少的质疑，随后对差异的点也会进行一些基于基因和蛋白水平的验证，以求探求事物的真相，给结果一些多的佐证。随着生物信息学的不断发展，各种数据库的完善，采用pathway的方法来研究的也越来越多，可以说也是一个趋势。其实，说到底，蛋白质组学研究的目的也就是为了探明细胞代谢，调控，疾病等等的机理。
个人的一点看法，大家接着讨论。
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发表于 2014-2-7 21:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白质组学是一个实验手段或工具，它能找到可能有某种生物学意义的目标蛋白候选物，接下来才是正式工作，用生物学手段如分子生物学等方法进行深入研究等进一步的工作。
如果用质谱鉴定出差异蛋白，当然会用western再去验证一下。一是你的结果从质谱和western两个方面都得到验证，更可信。二是后续的进一步实验不可能都用质谱鉴定，而western基本上是不可或缺的。
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ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得如果双向跑得很好，重复性很好，可以不做western，做一些功能鉴定是不是更好点！
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白质组学是一个实验手段或工具，它能找到可能有某种生物学意义的目标蛋白候选物，接下来才是正式工作，用生物学手段如分子生物学等方法进行深入研究等进一步的工作。
如果用质谱鉴定出差异蛋白，当然会用western再去验证一下。一是你的结果从质谱和western两个方面都得到验证，更可信。二是后续的进一步实验不可能都用质谱鉴定，而western基本上是不可或缺的。

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如果用质谱鉴定出差异蛋白，如何用western再去验证呢？
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