【求助】转膜以及丽春红染色问题

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标题:【求助】转膜以及丽春红染色问题

966735obeng[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在SDS-PAGE胶跑完后，一半考染，一半转膜，考染结果显示条带还是比较清楚的，转膜条件是：300mA，2h，转膜后用丽春红染色，把膜放入丽春红稀释液中5-10min，整张膜呈红色了，随后用去离子水冲洗，感觉是应该没有条带，随后我再拿转完的胶重新考染，发现Marker有比较清楚的几个条带，但是我的蛋白的条带很浅，比原先跑完胶后考染的条带浅很多，我想问一下，这样的现象是怎么回事？

966735obeng[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再问一下，我要的蛋白是170kDa和43kDa，在转膜时，我用的是恒流300mA，一开始的时候电压达到200多伏，随后逐渐降低，转2h后基本上在120v左右，这是正常现象吗？谢谢！

966735obeng[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不好意思，说错了，是400mA。想问一下，如果想转170和43kDa的蛋白，一般转膜条件是什么？湿转。PVDF膜除了在转膜缓冲液中平衡外，还需要做什么预处理吗？我看到有不同的转膜缓冲液，像我这样的情况，用什么配方的转膜缓冲液比较好？问题很多，不好意思哈

quiqui008[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

湿转我们一般都是100-120V（稳压），转2.5-3.0h。注意不要有气泡和短路。
转印缓冲液配方：
Tris 碱 (12mM) 1.45 g
甘氨酸 (96mM) 7.2 g
甲醇（20％终浓度） 200 ml
去离子水加至1L
总体积 1L
PVDF膜－预先将PVDF膜在甲醇，乙醇或异丙醇中湿润。在去离子水中稍事润洗后，将膜放入含50-100ml转膜缓冲液的浅盘中放置数分钟。
硝酸纤维素膜/尼龙膜－直接放入转膜缓冲液中数分钟。
滤纸－在临使用前在转膜缓冲液中简单浸泡一下。
凝胶－凝胶应在跑完后立刻使用。不要将凝胶浸泡在转膜缓冲液中。
硝酸纤维素膜对于常规使用非常好。对于小的多肽，建议使用小口径的膜。
PVDF比硝酸纤维素膜更疏水，其适用于蛋白测序。
尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合。主要用于Northern和Southern。
因此你的试验建议使用硝纤膜。

966735obeng[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢，我们实验室目前只有PVDF膜，我想问一下，我的实验用PVDF膜做可以吗？还有，我的转印缓冲液配方是：
Tris 碱 5.81g
甘氨酸 2.9 g
甲醇（20％终浓度） 200 ml
去离子水加至1L
总体积 1L
这个配方是不是不能用在我的实验中？谢谢

tie8[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以用PVDF膜做的，之前要用甲醇激活一下，然后用转膜液浸泡即可。170kDa转膜时间可稍长，200mA2.5小时应该可以了，而且42kDa也不会转过。我觉得你的转膜液配方好像有点问题，不知你按这个配方做出来没有。

hyuu[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

配方里缺0.37克SDS。

966735obeng[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哦，不好意思，我忘记写了，我加了0.37gSDS，但是好像和前面回复我的civcul 的转膜配方不一样，想问一下，有什么区别吗？我预先没有用甲醇激活PVDF膜，是不是这个就是做不出来的主要原因呢？谢谢哈

tudou85[使用道具]
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发表于 2014-2-7 21:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

借用你的板块讨论一下：半干转膜，小分子量（40-60KD），恒流，电流为面积*2.5，时间30min，效果很好！但是大分子量（140-220KD）,恒流，电流也是面积*2.5，时间为1小时，没有看见条带！有经验的战友请指点！