蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】关于BL21 Codon Plus(DE3)RP的使用

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 11  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】关于BL21 Codon Plus(DE3)RP的使用

qumm1985[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76908
精华 1
积分 475
帖子 546
信誉分 102
可用分 3616
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
1

发表于 2014-2-8 09:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于BL21 Codon Plus(DE3)RP的使用

由于我的基因GC含量很高，所以我想用BL21 Codon Plus(DE3)RP为宿主表达蛋白，载体是pUC18，我想问一下该菌株是否有抗性？如果和载体的抗性不同，最后的培养基是不是两种抗性都要带？如果是做感受态细胞的话，还用加抗生素嘛。 还有他的培养基LB可以吗，SOC是不是必须的啊。
还有关于转化后提质粒的问题，该菌株是表达菌株，可总的提质粒鉴定啊，在培养过程中质粒会不会丢失啊。第一次接触该菌株，请大家给点意见吧。
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
2

发表于 2014-2-8 09:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

表达载体pUC18不是克隆载体吗？能进行表达吗？BL21 Codon Plus(DE3)RP和Ｅ.coli BL21 (DE3)有什么区别呀？
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
3

发表于 2014-2-8 09:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BL21 Codon Plus(DE3)RP为BL21（DE3）的改造株，特点是带有一个氯霉素抗性的质粒，用于表达大肠杆菌的识别稀有密码子的tRNA。
培养时，应注意添加15～30ug/mL的氯霉素(母液用无水乙醇配制），转入表达载体的话，应同时添加相应抗生素。
顶部
qumm1985[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76908
精华 1
积分 475
帖子 546
信誉分 102
可用分 3616
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
4

发表于 2014-2-8 09:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那平板培养和液体前培养及诱导都需要两种抗生素嘛。对于表达蛋白有什么需要注意的地方啊。谢谢。还有提质粒，可以用来鉴定吗。
顶部
yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
5

发表于 2014-2-8 09:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

平板培养和液体前培养及诱导都需要氯霉素＋表达载体抗性对应抗生素，其余和普通诱导没什么区别。
关于提质粒，一般都不推荐BL21菌株提质粒，如果要在菌株中保质粒，建议使用JM系列，DH5α，TOP10，XL1-Blue MR等菌株，这些菌都是endA1- recA1- 基因型的，无Endonuclease I 酶活性，有利于质粒的完整和稳定，同时可以减少克隆DNA的非特异性重组。
而且RP这株菌本身是带质粒的，虽然是低拷贝，但还是有可能污染你提得质粒，因此不推荐用它提质粒。
另外特别提醒，培养和保种RP一定要加氯霉素，否则会造成其表达稀有密码子tRNA的质粒丢失！！
顶部
qumm1985[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76908
精华 1
积分 475
帖子 546
信誉分 102
可用分 3616
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
6

发表于 2014-2-8 09:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思，还有个问题，转化BL21 Codon Plus(DE3)RP后，不提质粒鉴定，如果没表达，我怎么能确定质粒转化一定成功呢。只需要转化后直接挑取单克隆培养诱导表达嘛。是不是常规就是这样做啊。再次感谢你的回复。
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
7

发表于 2014-2-8 09:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果没转化成功，根本不会在相应的抗性板长出来，当然如果你的抗生素失效这种情况不算，如果你的转化产物只长出一两个菌也不算。所以转化一定要做阴性和阳性对照。
至于你说的检测问题，我们都是挑2～3个克隆，37度培养，直接做菌液PCR验证就好了，干嘛非要提质粒，酶切验证其实是比较粗的验证手段。
如果非要提质粒，那检测级也肯定没问题，但不建议以BL21系列来保存和扩培质粒。
顶部
avi317[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
8

发表于 2014-2-8 09:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
GC含量高，不一定就是含有稀有密码子，只能说概率比较高而已。比如E.coli中编码Proline的稀有密码子是CCC，所以GC含量高的话出现CCC作为Pro的概率比较大。
具体到一个蛋白，那就先分析一下，看有多少稀有密码子。磨刀不误砍柴工啊。
这个菌株携带了一个质粒，与你的表达载体应该是兼容的，所以你表达时的菌株实际上携带了两个质粒。
顶部
莲花白[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74499
精华 1
积分 286
帖子 247
信誉分 102
可用分 2016
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
9

发表于 2014-2-8 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近做实验也需要你这个菌株BL21 codon-plus (DE3) RP，但是我们一直找不到这个菌株，我们能否用其他的菌株或者质粒跟您交换，如果需用钱买的话，也可以，所以请你有空时跟我联系。
顶部
PINK[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73133
精华 0
积分 418
帖子 536
信誉分 100
可用分 3488
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-19
状态 离线
10

发表于 2014-2-8 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BL 21 Codon Plus (DE3)RP中的R,P是指适合于Proline-rich（ccc）和Arginine(AGA,AGG) 含量高的蛋白质的表达，因为一般的菌株表达不下去。做表达之前，先看一下你的编码区的氨基酸序列，再决定。
PUC19 好像不是表达质粒，与DE3系列兼容的可以用pET-23a/d系列不错。
DE3菌株系列部分蛋白酶缺失，有利于保护外源表达的蛋白质降解较少。
顶部
 11  1/2 12››