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标题:【求助】蛋白纯化与测序

hustwb[使用道具]
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发表于 2014-2-8 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白纯化与测序

各位大虾，我通过WB方法确定一种受体蛋白的存在，分子量大约在85KD左右，我想问一下，如果继续做下去，可以通过跑胶之后的初步纯化，来进行样品的测序吗？这样做会不是因为有太多的杂事而无法测序或打质谱之类的，请指教，谢谢！
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发表于 2014-2-8 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你的抗体能做免疫沉淀，可以先把该蛋白亲合纯化下来，再跑电泳，切胶做质谱。
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发表于 2014-2-8 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我表达了个麦芽糖融合蛋白，54KD左右，但目的蛋白只有10KD，送质谱测序只测到了麦芽糖（表达前碱基测序是正确的），不知道楼上的可否指教下，我怎样才能鉴定我的目的蛋白呢？谢谢
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发表于 2014-2-8 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 zwsyrt 于 2014-2-8 10:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我表达了个麦芽糖融合蛋白，54KD左右，但目的蛋白只有10KD，送质谱测序只测到了麦芽糖（表达前碱基测序是正确的），不知道楼上的可否指教下，我怎样才能鉴定我的目的蛋白呢？谢谢 ...

最简单的方法应该是用你的目的蛋白的抗体做western，如果在54kd左右出带应该证明你购建成功了。
如果用质谱测不出情况可能就有些复杂：1. 最好用液质连用的串联质谱进行鉴定。2. 将你的目的蛋白纯化后在54kd切胶送质谱检测。3. 如果结果没有你的目的蛋白，可以试着将你融合蛋白的序列做成数据库，然后用质谱原始数据对该数据库进行比对，如果发现包含你目的蛋白的多肽就成了。4.如果还做不出来，你得分析你目的蛋白的信息，一般质谱分析时用trypsin将目标蛋白消化后测定多肽，如果你的目标蛋白不含胰蛋白酶的酶切位点或胰酶很难在你的目标蛋白内酶切就得换其他蛋白酶才行。
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发表于 2014-2-8 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我前3步都做了，还是不行，那么我怎么看我的目标蛋白是否含胰蛋白酶位点呢？请指教，谢谢！
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发表于 2014-2-8 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在网上预测了，有14个胰蛋白酶切位点哦，还有什么方法吗？
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发表于 2014-2-8 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在时间比较紧，3月份就要毕业预答辩了，现在被这个问题困扰住，不知道是不是我的目的蛋白太小了，质谱覆盖又有一定的比例，所以测不出呢？到底还有什么鉴定方法
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发表于 2014-2-8 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是有可能蛋白太小导致质谱覆盖率的问题。
个人认为当前第一步是确定你的54kd的条带确实是你表达的融合蛋白而不是其他：你基因序列已经通过，而且该条带还能质谱测出麦芽糖结合蛋白，应该说已经挺有说服力了。你可以用麦芽糖结合蛋白的抗体去做你融合蛋白的western, 同时用单独表达的麦芽糖结合蛋白做对照，如果在相应的分子量都能出条带，应该是你表达出目标蛋白的一个证据，虽然不那么直接，可能也够用了。
如果一定要找直接证据，一是去找该蛋白的抗体，另外如果你的目的蛋白在融合蛋白的N端可以试试做N端测序。
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发表于 2014-2-8 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那有没有麦芽糖蛋白的标准品呢？如果我的条带比麦芽糖蛋白大，是否也可以间接说明呢？还有就是N端测序一般送什么公司测，价格如何呢？请楼上指教，谢谢
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-2-8 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我表达的蛋白是个片段，没有该段的相应抗体
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