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标题:【求助】包涵体溶解不好

xevin[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】包涵体溶解不好


我的包涵体在8M尿素中溶了1个多小时，仍然有混浊，没有达到清亮的程度，以前不是这样的。溶解不好，电泳条带就很窄很淡。难道说包涵体中还有其他不溶于尿素的东西？会是表达的问题吗？
很急！请大家帮助我！谢谢
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vcve[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很有可能你的核算没有除干净，可以尝试用2%的脱氧胆酸钠（NaDOC）来洗包涵体
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是现超声到没有粘稠，然后离心，去掉上清，沉淀用包含PBS,EDTA和TRITON的洗液洗两三次，得到的较干净的包涵体，然后再用尿素溶。这样操作有不合适的地方吗？
能不能说具体点，2%的脱氧胆酸钠（NaDOC）能不能加到上述洗液中？具体终浓度是多少？我加一些巯基乙醇行吗？为了让蛋白充分溶解。
还有就是这个蛋白做小量时条带很浓，一做大量条带就淡了，除了溶解的问题外会是表达的问题吗？但是我做大量时的表达条件和小量一致啊，包括诱导时机，诱导浓度和诱导时间。拜托指教
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我今天用巯基乙醇试着溶了一下，离心后还是有大量沉淀。真不知是怎么回事？
拜托哪位牛人帮帮我吧。
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cbou876[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说说我的办法：
1.可以考虑适当的提高一下溶解温度，比如30度~40度，当然也要看蛋白的耐受情况了；
2.延长溶解时间，1小时似乎短了一些；
3.可以适当调节一下溶解液的pH，比如在弱酸条件下溶解不好，可以试试8.0左右的弱碱环境。
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！我实验室有另外一个同学，她的蛋白就在常温下，不到半小时就能溶解的很好，很清澈，离心后只有很少的沉淀，我的蛋白跟她的相差很大，不知是不是蛋白的个体原因？
前两个方法我试一下，至于第三个方法，尿素本来就是弱碱的吧，可能不用调ph.
还有就是用适当提高溶解温度具体怎么操作呢？把蛋白置于加热到25度的水中吗？
真的很郁闷，蛋白溶不了，下面工作没法开展，卡在这儿前进不了，急需帮助！
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

尿素溶解不了，那就试试盐酸胍。
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是用盐酸胍溶以后不能上离子交换柱吧
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上站友建议我提高温度，但是提高温度会不会使尿素分解啊？
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-2-8 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现刚开始做细胞 每次盖子都是朝上放的 然后在酒精灯上过一下 没见什么污染
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