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标题:【讨论帖】讨论：有关跨膜蛋白问题，敬请高手参与！

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发表于 2014-2-8 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】讨论：有关跨膜蛋白问题，敬请高手参与！


本人手头有一基因，用TM-Pred software (cuturl('http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html'))预测出来有4个跨膜螺旋，但是使用细胞亚定位（同pEGFPN3融合）发现在细胞核和细胞质中都有表达。
现在望高手参与讨论把：
1.存在跨膜螺旋的蛋白就一定是跨膜蛋白吗？
2.跨膜螺旋的蛋白就一定不能在细胞核和细胞质中表达吗？
3.如何自圆我说，预测的跨膜螺旋并不影响其在细胞核和细胞质中表达？
因为老外编辑紧抓此问题不放，原文如下：
Best my knowledge, there is no report that transmembrane protein can be localized everywhere including nuclei in the cells without protein processing.
想从存在跨膜螺旋的蛋白就不一定是跨膜蛋白入手，但没有合适的佐证，能有文献支持作好！
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2014-2-8 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室也做了一部分生物质膜的工作， 这里和楼主共同探讨一下
1. 存在跨膜螺旋的蛋白应该就是跨膜蛋白，但跨膜蛋白不一定都有α-螺旋，因为还有一类革兰氏阴性菌， 线粒体和叶绿体外膜蛋白是以β -折叠形成 β barrel。
2. 跨膜螺旋的蛋白可以在细胞核和细胞质中表达， 存在于核膜或者转录过程中存在也是可以理解的， 除开某些亚细胞器的标志蛋白， 其他的膜蛋白的表达和存在领域其实是很广的。
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发表于 2014-2-8 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2014-2-8 13:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们实验室也做了一部分生物质膜的工作， 这里和楼主共同探讨一下
1. 存在跨膜螺旋的蛋白应该就是跨膜蛋白，但跨膜蛋白不一定都有α-螺旋，因为还有一类革兰氏阴性菌， 线粒体和叶绿体外膜蛋白是以β -折叠形成 β barrel。 ...

谢谢您的参与！你所讲跨膜螺旋的蛋白可以在细胞核和细胞质中表达不知道有否文献之类的证据否？若有，望能提供些。谢谢！
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发表于 2014-2-8 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

的确，通常来说，存在跨膜螺旋的蛋白的确很少在胞质中的。
建议楼主用pEGFPC载体融合地位一下。有时N载体会通过改变蛋白的结构，从而影响定位。如果如楼主所说存在四个的话，的确有些不太可能。
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小糖块[使用道具]
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 小中大

不过有点是肯定的，TM-Pred software软件预测肯定是会出现差错的，有些普通的螺旋也会被预测成跨膜螺旋的。
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-2-8 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 蛋白在细胞核和细胞质中都有表达，仅仅是GFP定位（在荧光显微镜下观察）的么？还是由WB检测到目的蛋白的？我曾经碰到过不稳定蛋白融合后出现截短表达的情况，只表达了载体上的蛋白，而目的片断未表达
2 融合蛋白有可能改变目的蛋白结构，那样的话，定位就不准确了
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发表于 2014-2-8 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 remenb 于 2014-2-8 13:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1 蛋白在细胞核和细胞质中都有表达，仅仅是GFP定位（在荧光显微镜下观察）的么？还是由WB检测到目的蛋白的？我曾经碰到过不稳定蛋白融合后出现截短表达的情况，只表达了载体上的蛋白，而目的片断未表达
2 融合蛋白有可能改变目的 ...

是GFP定位的,没有做WB检测到目的蛋白,暂时没有制作抗体.你所说只表达了载体上的蛋白GFP,现在编辑argue为表达部分GFP,但是我的基因2K左右,融合在GFP前,如因为后边ATG的第二次翻译,效率应该很低的,但是定位表达结果为均匀分布质\核内,假若目的基因为非均匀分布质\核内,观察结果应该在亮度上有所差异,但是结果为均匀分布.
融合蛋白有可能改变目的蛋白结构,但是作为商业性载体的pEGFP-N3肯定考虑到,所以用抗体结果最好,但是目前无,我的意思是在这个前提下如何提出一些可行的证据如文献等argue下编辑,让其打消疑虑.
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发表于 2014-2-8 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老外说的有道理，如果没有剪接加工的话，膜蛋白确实是不应该在核里面看到的。我们也做过几个膜蛋白的定位，没有在核里面看到表达的。呵呵，这个应该在投稿的时候就有思想准备的。
针对这个问题，个人意见：因没有抗体，可以用GFP抗体做一WB,检测下表达的融合蛋白（分别用pEGFP-N和pEGFP-C来做）的分子量，看是不是有截短现象。
如果有截短并且在细胞膜和细胞核都可见表达，就可以解释了，而且还是新东东，呵呵。
如果WB发现没截短，而且只定位在细胞膜，那就可能是由于GFP定位的artificial现象了。
还有一种可能：WB发现没截短，而且在细胞膜和细胞核都可见表达，那就不好解释了，还需要深入的实验进行验证到底是怎么回事。供参考。
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 小中大


QUOTE:
原帖由 applebook=213 于 2014-2-8 13:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

本人手头有一基因，用TM-Pred software (cuturl('http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html'))预测出来有4个跨膜螺旋，但是使用细胞亚定位（同pEGFPN3融合）发现在细胞核和细胞质中都有表达。
现在望高手参与讨论把：
1.存在 ...

首先说一点预测的东西不能全信
1存在跨膜螺旋的蛋白不一定是跨膜蛋白，一般预测的都是alpha螺旋的结构，和跨不跨膜没必然关系。所有跨外膜蛋白（包括细菌外膜和线粒体叶绿体外膜）都以beta-barrel结构穿膜但也可能在末端存在alpha螺旋游离或插在barrel中间，其他跨膜蛋白都是以alpha螺旋作为穿膜结构的。但是alpha螺旋和beta折叠是蛋白质二级结构在所有蛋白中都可能存在
2所有transmembrane protein在成熟前翻译后基本上会和chaperon结合的，在这段时期，会可能有部分二级结构存在（这点好像和你的问题无关)
3你的亚细胞定位的结果更solid，说明你的目的蛋白不是穿膜蛋白，不明白你为什么要把它说成穿膜蛋白呢？
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applebook=213[使用道具]
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发表于 2014-2-8 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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原帖由 lixi559 于 2014-2-8 13:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老外说的有道理，如果没有剪接加工的话，膜蛋白确实是不应该在核里面看到的。我们也做过几个膜蛋白的定位，没有在核里面看到表达的。呵呵，这个应该在投稿的时候就有思想准备的。
针对这个问题，个人意见：因没有抗体，可以用GFP ...

好见解!赞一个!老外编辑就是建议这样确认下,因为文章投稿只是个小文章,同时涉及以前的实验,现在也无法再深入做下出(工作原因),所以才投稿到小杂志上,所以不想再用GFP抗体做WB,只是从写作技巧上弥补达到,从现有文献中引用支持本论.从写作技巧上,还有难度,难道真成死结了吗?
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