小中大【求助】ECL发光法背景高怎么办?
本人最近一直在做WESTERN BLOT ，一直按照同学教我的方法进行，虽然可以看到我的目的条带，但是背景很高，不知道问题出在哪里，我说一下的操作步骤导！
配胶、上样、跑胶、半干转无特殊，半干转后，就用TBST浸润一下后放入封闭液（试过5%牛奶、5%BSA）2小时，后取出直接抗体孵育（目标蛋白抗体1：1000、1：1500、1：2000【建议浓度1：1000-3000】，二抗1：2000、1：3000、1：5000【建议浓度1：1000-5000】，内参beta-actin差不多，目标蛋白4度过夜，内参室温2小时），孵育完后，TBST洗三次，每次10min，后二抗孵育，完后同样TBST洗三次，每次10min，后进行ECL发光液浸润2min，暗室压片2min(主要问题是在暗室中可以看到整张PVDF膜都有荧光，郁闷），显影定影，结果在胶片PVDF膜位置很黑，虽然可以见到我的条带，但是无法使用，不知道究竟怎样解决？（实验室另一位同学不存这样的问题）
试过几次都是同样的问题，是封闭的不好？抗体稀释度不够？TBST洗得不好？ECL发光步骤问题？
