蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】细菌发酵液蛋白质盐析法，应该怎样操作？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 21  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】细菌发酵液蛋白质盐析法，应该怎样操作？

mogu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71748
精华 1
积分 349
帖子 313
信誉分 102
可用分 2461
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态 离线
1

发表于 2014-2-8 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】细菌发酵液蛋白质盐析法，应该怎样操作？


各位蛋白方面的专家战友，小弟从水体中分离出一株对真菌有拮抗作用的细菌，想探讨拮抗物质的特性，用乙醚提取细菌发酵液的提取物没有拮抗活性，所以猜想拮抗物质应该是蛋白性质的；参照文献所述，采用硫酸铵盐析的方法从发酵液中沉淀出蛋白，然后检测粗提物的拮抗活性。参考了几篇文献，虽然都是采用硫酸铵盐析的方法，但是具体的操作却不同，如硫酸铵的饱和浓度、粗提物的溶解（Tris-HCl或磷酸缓冲液），特别重要的是对蛋白提取的过程描述不详细；希望各位兄弟姐妹能够给我解答，小弟在此谢谢了！
今天晚上小弟第一次用硫酸铵盐析法提取细菌发酵液蛋白，操作如下：将细菌72h发酵液10000r/min离心30Min后，将上清液过滤得到无菌发酵滤液；量取100mL次发酵滤液放入500mL的烧杯中，采取70％硫酸铵浓度盐析蛋白，一称量勺一称量勺地向烧杯中加入硫酸铵（整个操作均在冰水浴中进行），每加入一勺后，就用玻璃棒搅拌直至其溶解，后来发现搅拌后溶液中地泡沫很多，于是就采用晃动烧杯的方法加速其溶解；在实验前我也査了一下这方面的资料，说用少量多次的加入硫酸铵，整个加入硫酸铵的过程，今晚我用了2h才加好硫酸铵，70％饱和度下，滤液成浑浊状，然后将其放入了4℃冰箱。
根据我今晚的操作我想请问大家：
1、添加硫酸铵时应该怎样加，所谓的“少量多次”，具体每次该加多少，比如100ml量的样品，应该分几次添加较为合适，今晚我用了2h来完成硫酸铵的加入是否太长了？
2、加入硫酸铵后是否能用玻璃棒搅拌，搅拌后是否会使蛋白变性；
3、将加好硫酸铵后的样品4℃冰箱静止过夜后，明天离心取蛋白时，是将100mL的样品全部用于离心，还是将上清倒掉，只是取沉淀离心？
4、离心后的蛋白质粗提物沉淀，用什么溶解比较合适：Tris-HCl，还是磷酸缓冲液，浓度用多大的？谢谢！
顶部
xyw5[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75137
精华 1
积分 620
帖子 815
信誉分 102
可用分 4991
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
2

发表于 2014-2-8 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现在你只是猜想起作用的是蛋白质，你用盐析也只是初步浓缩，另外你还不清楚你蛋白的等电点，分子量等物理性质，只是明确细菌的发酵液有抗真菌的作用，对么？
你的盐析过程没什么问题，另外你可以把硫酸铵研磨更细一些，溶解也会更快一些，70%饱和度是你参考文献还是你摸索出来的？搅拌过程出现泡沫既有可能是杂蛋白沉淀太多的缘故，你可以试试不同饱和度的硫酸铵沉淀，摸索你目的蛋白析出的硫酸铵浓度
对于沉淀以后溶解的问题，你可以采用不同pH的Tris-Hcl来溶解，通常浓度20mM，现在最重要的是确认发酵液的抗真菌的作用，你也可以直接采用超滤浓缩的方法，还有一点就是如果发酵液中蛋白能稳定存在，而且浓缩后，活性会增高，你可以把发酵液的pH值及其成份作为你溶解沉淀的参考缓冲液
顶部
mogu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71748
精华 1
积分 349
帖子 313
信誉分 102
可用分 2461
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态 离线
3

发表于 2014-2-8 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
确实现在只是猜测拮抗物质是蛋白质，更不要谈什么分子量什么的了！因为我用乙醚对发酵液提取后，发现提取液蒸干后的溶解液采用琼脂扩散法没有拮抗作用，而乙醚提取后的下层发酵液中还是有拮抗作用的，也就是说乙醚没有把拮抗物质提取出来，所以怀疑拮抗物质应该是蛋白类的（乙醚不会对蛋白的活性影响吗？）
用70％的饱和硫酸铵是参考别人的文献的，因为别人也是对拮抗菌发酵液提取拮抗蛋白的。
我测定过发酵液的PH值，为8.7的样子，如果降低pH，则拮抗活性会降低。
我今天上午配好了tris-hcl缓冲液，因为没看你的帖子，所以浓度采用，50mm，pH值为7.5的样子。
顶部
mogu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71748
精华 1
积分 349
帖子 313
信誉分 102
可用分 2461
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态 离线
4

发表于 2014-2-8 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对了，再请教一下，tris-hcl高压灭菌应该没有关系吧！
经过一晚上的沉淀，感觉发酵液还是和昨晚一样的浑浊，没见有什么沉淀！
顶部
youyou99[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75216
精华 0
积分 583
帖子 765
信誉分 100
可用分 4756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
5

发表于 2014-2-8 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
确实现在只是猜测拮抗物质是蛋白质，更不要谈什么分子量什么的了！因为我用乙醚对发酵液提取后，发现提取液蒸干后的溶解液采用琼脂扩散法没有拮抗作用，而乙醚提取后的下层发酵液中还是有拮抗作用的，也就是说乙醚没有把拮抗物质提取出来，所以怀疑拮抗物质应该是蛋白类的（乙醚不会对蛋白的活性影响吗？）
用70％的饱和硫酸铵是参考别人的文献的，因为别人也是对拮抗菌发酵液提取拮抗蛋白的。
我测定过发酵液的PH值，为8.7的样子，如果降低pH，则拮抗活性会降低。
我今天上午配好了tris-hcl缓冲液，因为没看你的帖子，所以浓度采用，50mm，pH值为7.5的样子。

==========================================================================================================

如果pH在9左右呢，拮抗活性会降低么？你可以把Tris-Hcl pH调到8.5或9呀，既然你知道pH降低，活性也会降低，为什么还用7.5的pH呢？
Tris做蛋白一般不用灭菌
你的发酵液去除细菌后还是混浊的么？建议过0.45um的膜，去除细菌
顶部
mogu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71748
精华 1
积分 349
帖子 313
信誉分 102
可用分 2461
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态 离线
6

发表于 2014-2-8 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，看到你的解答时我也突然意识到，应该把pH值调到跟发酵液的浓度一样，但那时我已经配好了tris－HCl溶解好了蛋白！
我昨天将静止一晚上的发酵液（80ml,70％硫酸铵沉淀）离心后，倒去上清液，然后用8ml tris－HCl（7.5）溶解了蛋白沉淀，并测定了沉淀蛋白的对真菌的拮抗活性，发现此沉淀是表现出了拮抗活性，但是活性大小没有发酵液活性大（与pH调整至7.5后的发酵液比较），这是为什么呢？理论上应该要大啊，因为沉淀蛋白后加入tris溶解的体积是原体积的1/10，即蛋白含量应该是发酵液的10倍才对。难道是拮抗活性的蛋白没有全部沉淀下来，还是活性受到了影响？
通过硫酸铵沉淀后表现出的拮抗活性，可以推断出拮抗物质为蛋白类的了。但是我发现温度对此蛋白怎么影响不大啊？我测定了一下温度对发酵液拮抗活性的影响，100℃下45min，对拮抗活性还没有影响；121℃才有一点影响！有这么耐高温的蛋白吗？另外如我上面所述的，乙醚对其也没有影响！
pH对发酵液拮抗活性的影响：随pH降低而减弱，pH值越大，拮抗活性也越强，大于10的时候，pH过大会抑制真菌的生长，所以也就无从考察pH过大时对拮抗活性的影响了！
顶部
xyw5[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75137
精华 1
积分 620
帖子 815
信誉分 102
可用分 4991
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
7

发表于 2014-2-8 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 蛋白能在100度甚至121度还能稳定存在，确实不寻常，如果这样的话，对你纯化还是非常有利的，你可以在100度高温，变性绝大部分杂蛋白，使其沉淀，然后离心取上清，相信上清中目的蛋白要纯很多。对于耐高温蛋白，也是有可能的，像Tag酶，就能在94度还是起作用，还有些细菌能存在于沸腾的温泉中
2 正如你所说，硫酸铵浓缩了十倍，但活性没有提高十倍，甚至降低了，一种可能就是硫酸铵没有沉淀目的蛋白，你测过沉淀后上清中的拮抗活性么？还有一种可能就是硫酸铵对活性的影响，你可以试试透析以后测活性么？
3 通过硫酸铵沉淀，可以得到有活性的物质并不能标明活性物质是蛋白。我觉得你可以先100度去除绝大部分杂蛋白，另外再TCA或硫酸铵沉淀发酵液，SDS-PAGE电泳检测是否存在蛋白，还有去除杂蛋白的发酵液不用硫酸铵沉淀，而采用透析膜浓缩，看拮抗活性有无变化，因为现在还不知道蛋白大小，你尽量选用截流量小的透析膜，以保留更多蛋白
4 对于pH，我相信单纯不同pH溶液对真菌的影响你也作过了
顶部
mogu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71748
精华 1
积分 349
帖子 313
信誉分 102
可用分 2461
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态 离线
8

发表于 2014-2-8 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
正如你所说，硫酸铵浓缩了十倍，但活性没有提高十倍，甚至降低了，一种可能就是硫酸铵没有沉淀目的蛋白，你测过沉淀后上清中的拮抗活性么？还有一种可能就是硫酸铵对活性的影响，你可以试试透析以后测活性么？”
我是在24孔板中测定发酵液拮抗活性的，通过观察菌落大小来判断有无抑制能力，因为如果采用琼脂扩散法的话在培养基上不能形成抑菌圈。
我今天也想起测定沉淀上清液活性，结果发现在其中的菌丝不能生长，但是不知道是否是硫酸铵浓度太大对菌丝的抑制，还有待进一步确认；
另外如果采用透析膜对蛋白沉淀透稀的话，我不知道选择多大规格的膜好，因为无法知道目的蛋白的分子量；
还有实验中我发现，如果对硫酸铵沉淀溶解液用微孔虑膜（0.22um）过滤的话，拮抗活性回降低。是怎么回事？因为硫酸铵被排除了一部分，因为我没有用培养基经硫酸铵沉淀做对照组。：（
顶部
remonte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114516
精华 1
积分 356
帖子 387
信誉分 102
可用分 2698
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
9

发表于 2014-2-8 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

透析膜是个问题,用MW1000截留的吧,这足够小了
“还有实验中我发现，如果对硫酸铵沉淀溶解液用微孔虑膜（0.22um）过滤的话，拮抗活性回降低。是怎么回事？因为硫酸铵被排除了一部分，因为我没有用培养基经硫酸铵沉淀做对照组。：（ ”看得不是很明白
顶部
mogu[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71748
精华 1
积分 349
帖子 313
信誉分 102
可用分 2461
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-30
状态 离线
10

发表于 2014-2-8 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是什么意思？是透稀膜孔径的大小？
实验开始，我没有用空白培养液做硫酸铵沉淀蛋白的对照组，直至昨天检测发酵液硫酸铵沉淀后的上清液是否有拮抗作用时才发现，硫酸铵能够抑制真菌的生长，而我对发酵液沉淀后的蛋白粗提物没有透稀，所以粗提物的tris－Hcl溶解物中肯定有硫酸铵吧，所以不能排除拮抗沉淀的拮抗作用是由于硫酸铵引起的！就像你所说的，要多设阴性对照组！
在实验中，为了排除杂菌对实验的影响，我又对粗提物的tris－Hcl溶解物进行了过滤（0.22um），发现过滤后的粗提物的拮抗活性降低了！
顶部
 21  1/3 123››